胸腺肽β4在小鼠卯母细胞和早期胚胎中的表达与(3)

2009;36(9)张岩等：胸腺肽鄄茁4在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达与分布规律

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5min，而后迅速置于冰上放置10min．c．向其中

加入1滋l(50U)M-MLV反转录酶、5伊反转录酶缓冲液4滋l、2.5mmol/LdNTP4滋l、0.1mol/LDTT2滋l和Rnase抑制剂1滋l，总体积控制在20滋l．d．37℃孵育1h，95℃加热5min灭活反转录酶活性，结束反应．实验中每个获取cDNA的实验处理重复3次．

1援7引物设计和PCR主要参数

本实验使用Premierpremier5.0软件进行引物设计．Tb4引物设计依据GenBank核酸序列X16053．外引物序列：正义引物，5忆TGTCTGACAAAC-CCGATAT3忆，反义引物，5忆GCAAGTTCTTTT-CCCTC3忆，退火温度55℃，扩增22个循环，产物699bp；内引物序列：正义引物，5忆ATCCTCT-GCCTTCAAAA3忆，反义引物，5忆CCTTCCTGCT-CAGTAGTTC3忆，退火温度55℃，扩增30个循环，产物220bp．PCR内参为Gapdh，引物设计依据GenBank核酸序列XM486720．外引物序列：正义引物，5忆ACCACAGTCCATGCCATCAC3忆，反义引物，5忆TCCACCACCCTGTTGCTGTA3忆，退火温度55℃，扩增20个循环，产物452bp；内引物序列：正义引物，5忆GGAAAGCTGTGGCG-TGAT3忆，反义引物，5忆AAGGTGGAAGAGTG-GTGAGT3忆，退火温度53℃，扩增30个循环，产物307bp．每个cDNA处理进行3次重复的外引物扩增，扩增产物再分别进行3次重复的内引物扩增．实验获得扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶中EB添加终浓度为0.5mg/L．电泳完毕后将凝胶置于紫外光凝胶成像仪中记录实验图像．1援8数据分析与统计

免疫组织化学和激光共聚焦图像采用

Image-pro-plus5.0软件进行灰度和荧光密度扫描，获得面积积分光密度(AIOD)数值．凝胶电泳图像采用LabWorks3.0软件进行IOD值扫描，因PCR获得的数据变异性较大，故首先将各处理中的IOD数值进行加权平行处理，然后丢弃2倍标准差以外的可疑数据．获得的数据最后使用SPSS16.0进行单因素方差分析，获得统计结论．

2结果

2援1Tb4在不同成熟水平卵泡中表达的免疫组织化学结果

免疫组织化学试验结果显示见图1，伴随卵泡发育，Tb4蛋白在卵母细胞中的表达量逐渐增高．该分子在初级卵泡的卵母细胞核、质区域呈现较弱表达．而其在后期卵泡的卵母细胞质中表达量明显升高，尤其在核膜处表达明显，核内呈现较弱表达．同时，Tb4在有腔卵泡的颗粒细胞中呈现较弱表达，在细胞核中没有分布．该分子在卵巢皮质与髓质细胞中均有分布，而在多数皮质肌层细胞的细胞核中有较高程度表达．Tb4蛋白在不同成熟程度卵泡的卵母细胞中表达强度如图2所示．

2援2卵母细胞与胚胎发育中Tb4蛋白免疫荧光组织化学的激光共聚焦结果

激光共聚焦结果显示，以染色质构型不同划分的三类发育潜力不同的GV期卵母细胞当中，Tb4蛋白的定位表达有所差异．在弥散状染色质构型(nonsurroundednucleolus，NSN)的卵母细胞中，该分子在胞质中分布程度略高于核区，并且在核膜处表现为集中的分布(图3-A)；在不完全环绕核仁染色质构型(partlysurroundednucleolus，PSN)中，其在核内的分布量略有升高(图3-B)，而在核膜处

A1B1C1D1E1

A2B2Bar:C2100滋m

D2E2

Fig.1Immuno鄄histochemistryresults:Tb4peptideexpressioninovarianfolliclesofdifferentmaturelevels

Numbersnote:1:ParaffinsectionswithHEstained;2:Immuno-histochemistryresultsofTb4expression.Lettersnote:A,B:Primaryfolliclesofdifferentmaturatelevels;C:Secondaryfollicles;D:Tertiaryfollicles;E:Maturefollicles.