胸腺肽β4在小鼠卯母细胞和早期胚胎中的表达与(2)

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生物化学与生物物理进展司)，罗丹明标记的鬼笔环肽(rhodanmine-phalloidin,Cytoskeleton公司)，hoechst33258(Sigma公司)，M-MLV反转录酶(Promega公司)．Taq酶和其他PCR试剂均购自宝生物公司．培养用试剂均为Sigma公司产品，实验用其他药品为分析纯级别国产试剂．

CO2培养箱(Forma公司)，电子分析天平(MettlerToledo公司)，摄像显微镜与激光共聚焦显微镜(Leica公司)，梯度PCR仪(Bio-Rad公司)，紫外光凝胶成像仪(UVP公司)．1援3卵母细胞和胚胎的获得

雌鼠注射5U孕马血清(pregnantmareserumgonadotropin，PMSG)48h后，取卵巢，扎取颗粒细胞完好、形态完整的颗粒细胞卵母细胞复合物(cumulus-oocytecomplexes，COCs)．经透明质酸酶去除颗粒细胞后，选取GV期细胞进行培养，在培养过程中选取所需成熟水平的卵母细胞进行实验研究．胚胎采用雌鼠注射5U孕马血清48h后，再注射5U人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hCG)并与雄鼠合笼交配的方法获得．依据小鼠胚胎发育日龄依次获得受精合子、2细胞胚胎直至早期着床囊胚．同时进行合子的体外培养，并挑选出不同发育时期的胚胎进行实验研究．

卵母细胞成熟培养液是添加了4g/LBSA和0.2g/L丙酮酸钠的a-MEM液体培养基(Gibco公司)，胚胎培养液为添加了2g/LBSA的自制KSOM培养液．实验中其他用液均参考文献[20]配制．培养条件为：饱和湿度、恒温37℃、5%CO2．1援4石蜡切片HE染色和免疫组织化学实验步骤

常规方法制备由孕马血清(PMSG)调控的不同生殖周期的小鼠卵巢石蜡切片，连续切片厚度为4滋m．HE染色用染料为爱氏配方苏木精和1%的伊红Y水溶液．免疫组织化学方法流程为：a．常规脱蜡复水处理后，切片使用10mmol/L柠檬酸钠水溶液(pH6.0)进行抗原修复，80℃处理20min．10%过氧化氢甲醇溶液进行内源性过氧化物酶的灭活，室温10min．b．复水后切片经含有10%封闭用马血清的PBS溶液37℃封闭非特异性抗原1h．c．倾出封闭液，直接滴加1∶50体积比例稀释的一抗封闭液，200滋l/片，4℃过夜．d．含0.1%Tween20的PBS清洗液清洗3次，每次5min．e．滴加1∶200体积比例由封闭液稀释的生物素标记二抗，200滋l/片，37℃孵育1h．f．清洗液清

Prog.Biochem.Biophys.2009;36(9)

洗3次，每次5min．g．滴加1∶200体积比例由封闭液稀释的HRP标记链酶卵白素，37℃孵育1h．h．清洗液清洗3次，每次5min．i．DAB显色液显色．j．常规脱水，中性树脂封片，摄像显微镜拍摄记录实验图像．

1援5小鼠卵母细胞和早期胚胎免疫荧光组织化学实验步骤

本实验免疫荧光组织化学流程为：a．各处理待研究卵母细胞和早期胚胎，首先用4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)进行室温固定30min．b．经0.1%Tween20的PBS清洗液简单清洗后，加入含0.5%TritonX-100的PBS中作室温透膜处理30min．c．清洗液清洗3次，每次5min．d．封闭：移入含1%BSA的PBS中，37℃封闭非特异抗原位点1h．e．封闭后的样本首先与含1∶50体积比例的一抗封闭液4℃共同孵育过夜．f．清洗液清洗3次，每次5min．g．加入1∶100体积比例由清洗液稀释的FITC标记抗山羊二抗孵育液室温孵育1h．h．清洗液清洗3次，每次5min．i．样本与100nmol/L由PBS稀释的罗丹明标记鬼笔环肽溶液共同室温孵育30min．j．使用钠钾生理盐水溶液清洗1次，5min．k．最后与10mg/L浓度的hoechst33258钠钾生理盐水溶液共同室温孵育15min．l．使用钠钾生理盐水溶液清洗3次，每次5min，清洗结束后使用抗荧光猝灭剂对样本进行封片．

Tb4、微丝及染色质分别通过FITC-antibody(绿色)、Rhodamine-phalloidin(红色)和hoechst33258(蓝色)定位，使用激光共聚焦扫描显微镜观察三者分布状态，拍摄记录实验图像．1援6卵母细胞和胚胎cDNA的获取步骤

mRNA获取步骤：a．挑选形态、大小正常的卵母细胞或胚胎放入DEPC灭菌水配制的酸性台氏液中处理1min，去除透明带．b．将去透明带的胚胎移入M2操作液中洗涤2次．c．将胚胎移入薄壁离心管中，尽量不附带多余液体．d．向离心管中加入4滋l裂解液、1滋lDNase、1滋lDNase缓冲液和1滋lRNA酶抑制剂，37℃孵育40min．e．经65℃10min灭活DNA酶，消化后的产物即为总RNA模板．裂解液配方为：NaCl10mmol/L，Tris10mmol/L，MgCl23mmol/L，NP400.5%，DEPC灭菌水配制，调pH值至8.0．

反转录步骤：a．取所有消化后得到的RNA，向其中加入1滋loligodt(500mg/L)．b．70℃孵育