总RNA的提取定量与RT-PCR(4)

南医实验报告

（二）RT-PCR

1. 总RNA的提取：见前述内容。

2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒为例。 （1）在0.2ml微量离心管中，加入以下：

总RNA 1-5 μg 、dNTP 1 μl 、Random primer 1 μl 、补充适量的DEPC H2O使总体积达10 μl。轻轻混匀、离心。

（2）PCR仪上65℃加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 （3）然后加入下列试剂的混合物：

5×PrimeScript buffer 4 μl 、RNase inhibator 0.5 μl 、RTase 1 μl 、RNase free H2O 4.5 μl ， 轻轻混匀，离心.

（4） 30℃孵育10 min。 （5） 42℃孵育60 min。

（6）于70℃加热15 min以终止反应，将管插入冰中。

3．PCR：[本次实验采用Premix Taq Version2.0(Loading dye mix)试剂]

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl 、上游引物（10pmol/L）2 μl 、下游引物（10pmol/L）2 μl 、dNTP(2mmol/L) 4 μl 、10×PCR buffer 5 μl 、Taq酶（2U/μl） 1 μl 。 （2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心。

（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G-3-PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 （4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。

四、实验注意事项

1、本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

2、快速的操作，低温环境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。

3、加样原则是酶最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。