抗 CD20 嵌合抗体的表达与活性检测(3)

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中国生物工程杂志*[HA3<H1OB?[A1@1S>

表!%&’()!

"#$主要引物"*+,)*-./*"#$

功能碱基!"#,酶切位点$%&’,,,酶切位点!"#,酶切位点$%&’,,,酶切位点

-1@a;$W1aC;PP$

引物名称!"#!".!/#!/."上"下/上/下-"#,,-".,,*"#,,*".,,-/#,,-/.,,*/#,,*/.,,

碱基序列

$%&’(’!"!#$#’())’((((*’))()*’)’((’(*&+%$%&’(’##$"!!((()’(((**’)*(())(****&+%$%&’(’!"!#$#’()))(())’)**(*’(*(()*&+%$%&’(’##$"!!’)’)’*))()’**)(***(()&+%$%&((*))’))))))’**’’))()&+%$%&(*’’*’*(*(****()(()’’)&+%$%))**’’)))’**’*))(*’*&+%

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$&)()$$#!""’*((’**()(()*(((*(()(**’**(())()(()*&+

说明-"上游引物-"下游引物-/上游引物-/下游引物*"上游引物*"下游引物*/上游引物*/下游引物

()*,酶切位点01234序列

重叠片段

+,-.,酶切位点

!"#,酶切位点01234序列

重叠片段

/#0$,酶切位点剪接供体

"上游引物重叠延伸引物"下游引物/上游引物重叠延伸引物/下游引物

轻链可变区基因；引物合成及序列测定由上海博亚公司完成-"：-/重链可变区基因；*"轻链恒定区基因；*/重链恒定区基因；

!01细胞系及培养条件!06表达蛋白的纯化及初步测定

培养条件为.7879*/5&06细胞为本室保存，

，含$=加强型小牛血清),<*5）:6;培养基（

［］

（，培养于$=*5;、/>?@1AB）+CD温箱E。F3GH、.3IJH、F3K1IL、MIN43O细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，/"EP购自中国药品生物制品检定所，培养条!<7*由健康人血液分离，件均为F!7,6EQP培养基（，含$=胎牛血清),<*5）（，培养于$=*5;、/>?@1AB）+CD温箱。!02

转染#34细胞及筛选阳性克隆

转染采用,ARHON1SBA公司生产的"HT1UB?O3KHAB（按照试剂盒说OK）;PPP阳离子脂质体转染试剂盒，明书操作。对照采用空T,F8V载体及鲑精.W’转染*/5细胞。采用)Q6X（VHSK3）$PPS9K@加压筛!选，加压约6PJ后，挑出单克隆孔，以直接竞争

用无血清培养上清直接包被8",V’挑选阳性克隆，

W#W*(7酶联板QD过夜，+=<V’封闭后加入/F!

标记山羊抗人,S)（，孵育后加入(7<试剂显/Y"）色，Q$PAK测5.值。以无血清F!7,6EQP培养基为

C］

阴性对照［。!05

单克隆的扩大培养及蛋白收获

选择表达水平最高的基因重组*/5工程细胞系3AOH&*.;P&6<+于6PPPK@转瓶中用含;=小牛血清的.7879:6;培养基培养，待细胞长满瓶壁时，换为无血清培养基，隔天收液，可连续进行收液+Z$次。

利用蛋白’对,S)的特异性吸附作用，采用A!N1OBHA’VBT[3N1LBQ:3LO:@1\分离介质（’KBNL[3K进行亲和层析，纯化表达蛋白。操作方<H1L?HBA?BL）

法参见产品说明。纯化后，以紫外分光光度计测定按6]Q$’;XP&P]CQ’;EP推算蛋白’;EP和’;XP值，

X］

浓度［。以V.V&!’)8测定蛋白的纯度、分子量。!07

细胞89:;<检测产物的特异性

以*.;PY细胞F3GH、均为<IN4HOO.3IJH、F3K1IL（淋巴瘤细胞）检测表达抗体对*.;P的结合能力；以人白血病细胞株/"EP以及(淋巴瘤细胞株MIN43O、

均!<7*检测表达抗体与*.;P^细胞的结合情况，以!N1OBHA’洗脱缓冲液)@>&/*@为阴性对照。操

作时以细胞直接包被W#W*(7酶联板（经多聚赖氨酸处理），待细胞附于底部后，以戊二醛固定，+=孵育后充分洗涤，再加<V’封闭后加入表达抗体，入/F!标记山羊抗人,S)（，孵育后加入(7</Y"）试剂显色，Q$PAK测5.值。

!0!=检测产物对#>?=@细胞的杀伤作用

_，6P］

根据文献报道［，抗体与*.;P结合以后，能够引起细胞凋亡，从而达到消除肿瘤细胞的作用，

因此，我们将该抗体直接加入*.;PY细胞F3K1IL的培养体系中，观测抗体的杀伤细胞作用。在_E孔板中培养细胞，保持各孔细胞数目相等，将抗体稀释至P]$、$、$PS9K@+个浓度加入至相应细胞!孔，以’AAB‘HA-、+CD作用;Q[后，!,双染（’AAB‘HA