抗 CD20 嵌合抗体的表达与活性检测

!!"

：中国生物工程杂志$H;98<;E:LOH9EQE.R，&""?，&?（#）=GS=>

$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$!!!!!!!!!"

!!"

研究报告

!!!!!!!!!"

摘要关键词

抗!"#$嵌合抗体的表达与活性检测

师明磊胡显文#陈惠鹏高丽华李世崇

（军事医学科学院生物工程研究所

北京

!"""#!）

表达了基因重组抗$%&"嵌合抗体并对其生物学活性进行了初步鉴定。设计合成轻、重链

可变区序列；提取血液’()，通过’*+,$’得到人!、重链恒定区序列。运用重叠延伸-./!的轻、连接可变区与恒定区，将轻、重链基因连接至0-’12双表达载体。将质粒以阳离子脂质体转,$’，

共获得#株表达较高的克隆，表达量约为&6.75。扩大培养阳染$34细胞，15-2)挑选阳性克隆，性克隆89:;+$%&"+!<=，收获上清，以蛋白)进行亲和层析纯化表达蛋白。2%2+,)/1检测表明纯

化纯度达到>?@，蛋白相对分子量与理论值吻合。以$%&"A细胞’8B;、表明%8CD;、’86ECF检测，该抗体能与$%&"抗原特异性结合，体外杀伤试验说明抗体能够杀伤$%&"A淋巴瘤细胞。

非霍奇金淋巴瘤

$%&"

单克隆抗体

嵌合抗体

载体0-’12（。%3?$QE9:LOH）"感受态大肠杆菌、（%EC0FE9）*8[酶、,RNE\LF:酶、%()连接酶、*G多聚核苷酸激酶（、限制性内切酶!"#-、*G,(W）!"#--、限制性内切酶$%&’---、()"-均为*8W8’8产品，

*"+$-、,#-.-、/01-、/-2-为(1<公司产品。质粒提取、酶切产物回收分别采用,$’产物回收、

,NE6L.8公司];^8ND,QCF2_X;9;0NL0F%()];^8ND,$’0NL0F%()0CN;‘;O8:;E90CN;‘;O8:;E92RF:L6、

FRF:L6、];^8ND%()OQL89+C0试剂盒，’()提取试剂

。*N;^EQ（-9Z;:NE.L9）%&#

抗体轻、重链可变区的合成

=，G］

根据文献报道［及计算机模拟，我们设计合

非霍奇金淋巴瘤（9E9+3ED.P;9’FQR60HE68，

是最常见的血液系统恶性肿瘤，也是发病率增(35）

长最快的恶性肿瘤之一，我国每年约有=SG万人死于该病。目前的放、化疗对(35有部分疗效而副作用极大，因此研制更加高效低毒的药物很有意义。约T?@S>"@是<细胞淋巴瘤，而(35患者中，

$%&"是<淋巴细胞和<淋巴瘤细胞表面专有的膜表面蛋白，不表达于造血干细胞、原始<细胞、正常

!］

血浆细胞以及其它正常组织［。因此研制抗$%&"的单克隆抗体就可能专一性地杀伤<细胞和<淋巴瘤细胞，达到更好的治疗效果。美国/L9L9:LOH和-%1$公司开发的89:;+$%&"嵌合抗体于!>>#年获得是第一个用于肿瘤治疗的治疗性抗U%)批准上市，

体，由于其在非霍奇金淋巴瘤治疗中表现出较好的疗效和较低的毒副作用，已经成为美国销售额最大的抗肿瘤药物。本研究旨在研制抗$%&"嵌合抗体，并对其生物学活性进行初步检测。

成轻、重链可变区序列如下（见下页页首），该序列不仅在$%’=区与’;:CJ;68\不同，其U’G区采用人基因序列，因此人源化程度也较’;:CJ;68\更高。

异于’;:CJ;68\的部分用下划线标出。

因现有碱基合成水平只能精确合成T"个碱基以下的基因序列，过长则误差较大，为便于化学合成，根据以下原则设计合成基因的寡核苷酸片段：相邻的&条寡核苷酸片段间约有&"碱基互补，寡核苷尽量保证各互补寡酸片段长度一般长约#?个碱基，

核苷酸片段互补序列的退火温度一致。用重叠延伸

?］

重链可变区寡核苷酸片断［。,$’方法组装合成轻、

%材料与方法

%&%

载体、菌种及相应试剂

，0/1X+*18FR质粒0V$!>质粒（*8W8’8）

（，0O%()=Y!（质粒（，双表达,NE6L.8）A）-9Z;:NE.L9）

收稿日期：&""?+"!+&#

修回日期：&""?+"?+&G

电子信箱：HCIJ;89KL9M:F;9.HC8IEN.IO9#通讯作者，

总体顺序：下同）和&，!）将片段!（_5!或_3!、=和