大豆分离蛋白结构与性能(4)

　　生命科学家已经用cDNA的方法测出了组成大豆球蛋白和β2大豆伴球蛋白各个亚基的氨基酸序[8,15]列。理论上人们可以利用大肠杆菌等微生物作为生产这两种蛋白质的工厂,但是从基因工程的角度来获得纯净的大豆球蛋白和β2大豆伴球蛋白并不是材料学家、食品专家以及化学家的目的,因为一来基因工程的方法成本高,绝对产量低;二来从细胞中提取蛋白质并不比从种子中获得来得更为容易。因此科学家们一直在探索直接从大豆中分离和纯化大豆球蛋白和β2大豆伴球蛋白的方法。

人们最先想到的直接方法是超速离心,根据沉降速率不同,大豆蛋白大部分以7S和11S的形式从溶液中分级沉淀出来,7S部分主要为β2大豆伴球蛋白,11S部分则为大豆球蛋白。然而,超速离心分离。进行,和层析分离等。析分离以及二者结合的方法。但总体说来,目前人们尚未找到一种具有较高分离效率,而又经济适用,可以大批量分离纯化的方法。3.1　等电点沉淀

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Thanh和Shibasaki在1976年首次报道了利用等电点的不同来分离两种大豆球蛋白的方法。他们通过不同的tris缓冲液来调节大豆分离蛋白水溶液的pH值:当pH=614时,11S球蛋白(大豆球蛋白)能够从溶液中沉淀出来;当pH=418时,7S球蛋白(β2大豆伴球蛋白)能够从溶液中沉淀出来。作者还分析了不同蛋白质浓度、tris缓冲溶液浓度和离子强度对等电点分离效果的影响,结果表明蛋白质浓度

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和离子强度(当≤0104mol L时)对分离效果几乎没有影响;而tris缓冲液则是浓度越低分离效果越好。等电点分离需要解决的一个问题是精确控制溶

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液的pH到达蛋白质的等电点,因此Russell等在2001年提出了用挥发性电解质溶液———碳酸溶液体系来替代传统的水溶液,通过控制液面上方CO2的压力来精确调控溶液pH的。3.2　层析法

交换层析、疏水作用层析和亲和层析等。对于两种

不同的蛋白质,理论上人们总可以找到一种合适的层析介质,能够响应不同的理化性质而将两者分开。

β对于大豆球蛋白———2大豆伴球蛋白体系,首先它

们具有不同的分子大小,大豆球蛋白是亚基的六聚体,分子量约为350kD,而β2大豆伴球蛋白是亚基的三聚体,分子量约为180kD,因此凝胶过滤层析应该可以将二者分离开来,但由于它们的分子量处于同一数量级,在实际分离仍存在分辨率的问题。其次,氨基酸组成分析表明大豆球蛋白和β2大豆伴球蛋白含有的非极性氨基酸的比例不同,大豆球蛋白

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高于β2大豆伴球蛋白。Riblett等在研究二者表面疏水性的过程中发现β2大豆伴球蛋白在层析柱LunaColumn的保留时间(3—10min)短于大豆球蛋白的保留时间(22—35min),表明二者具有不同的表面疏水性,可以疏水相互作用层析来进行分离。3.3　其它方法

,。当溶液中的盐离子浓度到达一定数值时,后一种作用占主导,蛋白质从溶液中沉淀出来,即发生盐析作用。研究表明,大豆球蛋白和β2大豆伴球蛋白在同一种盐的作用下,发生盐析时所需盐的浓度不同,这为两者之间的分离提供了条

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件。Deak等采用用CaCl2为沉淀剂,NaHSO3为还原剂;Wu

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等采用NaCl作沉淀剂,均取得了一定

的分离效果。

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此外,Chove等采用两种不同微孔尺寸的醋酸纤维素微滤膜来分离大豆分离蛋白中两种主要的球蛋白,虽然得到了富含其中一种的分离产物,但通过这两种膜的分离均不能得到相对纯净的分离产物。

4　大豆分离蛋白的构象研究

β　　大豆分离蛋白中主要存在3种构象:α2螺旋、2折叠和无规线团,而这3种构象的含量随着大豆种类和产地的不同而有所不同。大豆分离蛋白由于其组分比较复杂,加上不同的原料来源和不同的测试手段及实验条件均给其构象的研究带来了一定的难