大肠杆菌_ggt原核表达载体pGEX_4T_1_ggt的构建及其蛋(3)

发布时间：2021-06-08

有意义

35卷30期　　　　　　　　　　　胥俊峰等　大肠杆菌γ2ggt原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt的构建及其蛋白表达9469

酰转肽酶基因,分别酶切载体和扩增目的基因,连接和转化,直至将重组载体转化大肠杆菌后进行克隆筛选、测序鉴定等,证实了该重组载体的构建成功,并进一步通过SDS2PAGE和Westernblot分析与鉴定了重组蛋白的表达。研究结果表

明,重组大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶经1g/L乳糖诱导1h后即开始大量表达目的蛋白,在诱导6h后表达蛋白量达到最高。随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,表达目的蛋白由于宿主菌含有的凝血酶的

　注:M.预染蛋白分子质量标准化;1.未诱导菌体蛋白;2～10.乳

糖诱导1～9h的菌体蛋白。

图5　重组大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶的Westernblot

切割作用,表达产生的约90kU的融合蛋白部分被切割为65kU的γ2谷氨酰转肽酶和25kU的GST融合标签;Westernblot鉴定同样在90和25kU位置处,用anti2GST单抗能够检测到呈现的条带,与SDS2PAGE电泳结果一致。参考文献

[1]KAMATHAB,WANGL,DASH,etal.Antigensintea2beverageprimehuman

Vgamma2Vdelta2Tcellsinvitroandinvivoformemoryandnonmemoryan2tibacterialcytokineresponses[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(10):6009-6014.[2]TACHIKIT,YAMADAT.γ2Glutamyltransferbyglutaminasefrom

pseudomonasnitroreducensIFO12694andforthesynthesesoftheanineandylm,1998,62(7):12792[3]YAYAM,TT.expressionofPseu2

dom30lutaminesynthetase:anenzymeavail2coupledfermentationwithenergytransfer[J].,2006,70(2):500-507.SUKAS,MIYAKAWAN,etal.Enzymeproductionoftheanine,an

umamicomponentoftea,fromglutamineandethylaminewithbacterialγ2Glu2tamyltranspeptidase[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2002,31:884-889.

[5]MEISTERA,ANDERSONME.Glutathione[J].AnnuRevBiochem,1983,52:

711-760.[6]TATESS,MEISTERA.Gamma2glutamyltranspeptidase:catalytic,structural

andfunctionaspects[J].MolCellBiochem,1981,39:357-368.[7]ALEKSANDRAMISICKA,IWONAMASZCYNSKA,ANDRZEJWLIPKOWSKI,

etal.Synthesisandbiologicalpropertiesofgamma2glutamyl2demorphin,apro2drug[J].LifeScience,1996,58(11):905-911.

[8]张毅,屈贤铭,杨胜利.乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响

[J].生物工程学报,2000,16(4):464-468.

个关键酶,它不仅可以催化γ2谷氨酰基化合物的水解反应

γ生成2谷氨酸,还可以催化γ2谷氨酰基化合物上的γ2谷氨酰基团转移至氨基酸、多肽、H2O等受体上

[6]

[5]

,利用这一性质,

γ氨基酸衍生物合成方面2谷氨酰转肽酶在药物合成设计[7]、

也有着重要的应用。为了获得高表达的目的产物,通常需要建立基因的高效表达系统。该实验将大肠杆菌k212的γ2ggt基因转入至原核表达载体pGEX24T21构建了重组质粒pGEX24T21/γ2ggt。原核表达载体pGEX24T21同时含有tac启动子和

lacI基因,tac是一个由trp启动子和lacUV5启动子融合而

成的杂合启动子,受lac阻抑物调控,度的阻遏蛋白,降低载体上tac,,IPTG达。由于IPTG,一些国家IPTG,因此其应用于生产合成茶氨酸所需的γ2谷氨酰转肽酶有一定的局限性,故该实验用无毒、价廉的乳糖[8]作为tac启动子的诱导剂来启动目的蛋白基因的转录,从而表达合成茶氨酸所需的γ2谷氨酰转肽酶。鉴于此,笔者利用基因工程技术构建重组原核表达质粒pGEX24T21/γ2ggt,在实验中通过PCR扩增大肠杆菌γ2谷氨

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1.3　自制暗场显微镜的方法和观察结果　在某些普通显微

要熟练掌握显微镜的使用技巧,还是较容易在40×物镜下观察和记录花粉的滚动过程和其立体形状。如果显微镜不具备摄像系统,可利用数码相机等自制一个摄像系统,制作方法见参考文献[2]。

(2)利用油镜油对花粉进行制片,不改变花粉的形态,并

镜的孔径光阑下面,有一个滤光片,在其中央用双面胶粘上一个小于孔径光阑口径的、不透光的圆纸板等物,就可将通过孔径光阑中央的光线遮挡住,这样就将一台明场显微镜改制成了一台暗场显微镜。利用它观察浸入油镜油中的花粉粒,整体呈乳白色,层次和结构较清楚(图3)。通过与明场显微镜下的花粉形态进行对比,

可获得不少新的结构信息。

能清楚地观察到其表面的形态和层次结构。如果能将显微镜进行一些结构改建,就可达到一镜多用的效果。若将花粉内的细胞核等结构或成分进行荧光等染色或进行光谱分析,将获得花粉内更多的结构和组成信息。随着光学显微镜的不断升级换代,光镜在观察花粉形状和结构信息等方面,将具有越来越多的电镜所无法取代的优势。

参考文献

　注:a为赤道光切面观的油松花粉;b为小叶女贞的赤道光切面

观花粉;c为海桐的赤道面观花粉。

图3　暗场显微镜观察到的花粉

[1]洪亚平.光镜下新鲜植物花粉的简易制片、观察和摄像方法[J].生物