有意义

9468　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年

PCR反应鉴定,将扩增出目的基因的重组质粒由上海生工生白为表达的融合标签GST蛋白,初步说明重组的目的蛋白得到表达,但有部分被切去融合标签,与预期结果一致。从图3可知,乳糖诱导1h后即开始表达目的蛋白,在诱导6h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解。

超声破菌后重组蛋白主要以包涵体形式存在(图4)。

物工程技术服务有限公司进行测序,测序结果与NCBI数据库中公布的序列比对。

1.2.5　SDS2PAGE分析γ2ggt目的蛋白的表达。经DNA测序验证的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取含重组原核表达载体的单个菌落接种于含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基,37℃培养过夜后,按1%接种于新鲜的LB培养基(含

50mg/L氨苄青霉素),37℃继续培养至OD600约为1.0时,加

入乳糖至终浓度为1g/L诱导9h,每隔1h取1ml菌液作全菌SDS2PAGE电泳,考马斯亮蓝R2250染色。当诱导重组蛋白达到最佳表达时间后收菌,4℃、10000r/m离心10min,弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨酰转肽酶裂解缓冲液重悬后,超声破碎菌体,4℃、12000r/m离心15min,分别取上清液和沉淀留样电泳。

1.2.6　Westernblot鉴定目的蛋白。将诱导表达的产物先行SDS2PAGE,然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜上,取下硝

酸纤维素膜TBS短暂漂洗后经5%光明脱脂奶粉室温封闭1

h,TBST漂洗3次后,与GST Tag单抗孵育过夜,次日TBST漂

注:γ　图2　插入pGEX24T21122

2谷氨酰转肽酶

洗3次后,与IRDye800标记的羊抗鼠IgG孵育1h,最后TBST

3次洗膜经Odyssey红外激光成像系统扫描实验结果。2　结果与分析

γ2.1　2ggt基因的扩增结果　α进行PCR扩增,p2对E.coliDH5

胶电泳结果显示,明亮的条带,

(1)。

2.2　重组质粒pGEX24T21/γ2ggt

的构建与鉴定　PCR扩增产物经纯化试剂盒纯化后,进行BglⅡ和

XhoⅠ双酶切,空载pGEX24T21进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切处理,分别纯

　注:M.预染蛋白分子质量标准化;1.未诱导菌体蛋白;2～10.乳

糖诱导的菌体蛋白。

图3　重组大肠杆菌γ2

谷氨酰转肽酶的SDS2PAGE分析

化后,T4连接酶16℃连接过夜,转

α,挑取单个菌落,37化E.coliDH5

℃培养过夜后,小量提取质粒,进行PCR鉴定(结果未显示),有约

　注:M.DNAmarker;1.PCR1.8kbp单一的特异性DNA条带出

产物。

PCR扩增产物琼脂糖

现的质粒由上海生工生物工程技果见图2,与GenBank中的E.coli

k212γ2ggtcDNA序列以Blast进行

　注:M.预染蛋白分子质量标准化;1.未诱导菌体蛋白;2.乳糖诱

导的菌体蛋白;3.乳糖诱导菌体蛋白的上清;4.乳糖诱导菌体蛋白的沉淀。

图4　重组大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶的SDS2PAGE分析

γ图1　2谷氨酰转肽酶基因术服务有限公司进行测序,测序结

凝胶电泳分析

比较,结果完全一致。

2.3　重组蛋白的SDS2PAGE电泳分析　挑取重组质粒转化BL21(DE3)的阳性菌落,过夜培养,转接新鲜的培养基后,当

OD600约为1.0时,加入终浓度为1g/L的乳糖诱导,每小时

2.4　重组蛋白的Westernblot鉴定　Westernblot分析显示,

取样用SDS2PAGE分析,结果表明(图3)γ,2ggt基因在pGEX2

4T21中是融合表达的,由于载体pGEX24T21在融合标签GST

经乳糖诱导的转化有重组原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt的菌体裂解物能与anti2GST单抗特异性反应,在90和25kU处呈现条带,而在65kU处未呈现条带,表明所表达的重组蛋白是目的蛋白(图5),与SDS2PAGE电泳结果一致。

3　讨论

后存在凝血酶酶切位点,宿主菌BL21(DE3)本身含有的凝血酶会在载体表达融合蛋白后切去部分融合标签,因此在90、

65、25kU处均有特征蛋白条带出现:分子质量约为90kU的

蛋白条带,为表达的γ2谷氨酰转肽酶与GST融合蛋白;65kU处的蛋白为切去融合标签的γ2谷氨酰转肽酶;25kU处的蛋

γ2谷氨酰转肽酶是生物转化法生产茶氨酸广泛采用的一种催化合成酶[4],作为生物体内谷胱甘肽代谢途径中的一