有意义

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(30):9467-9469　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李洪

大肠杆菌γ2ggt原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt的构建及其蛋白表达

胥俊峰,单建华,赵宁伟,殷志敏　(南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046)

摘要　构建大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt及表达与鉴定目的蛋白,为进一步利用该酶催化合成茶氨酸等目的

α总DNA为模板,用PCR法在γ产物奠定了基础。以大肠杆菌DH52ggt编码序列上下游引入酶切位点并扩增出γ2谷氨酰转肽酶基因;将

γ2ggt编码序列克隆入原核表达载体pGEX24T21的相应酶切位点;用PCR鉴定重组质粒pGEX24T21/γ2ggt,并对插入基因片断测序;重组质粒pGEX24T21/γ2ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导后用SDS2PAGE分析表达产物,并经Westernblot鉴定。获得大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶基因,并成功构建到原核表达载体pGEX24T21上,转化有pGEX24T21/γ2ggt工程菌BL21(DE3)经1g/L乳糖诱导1h后即开始表达目的蛋白,在诱导6h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,Westernblot鉴定了此目的蛋白。成功构建了大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt,并进行了目的蛋白的鉴定。

γ2谷氨酰转肽酶;克隆;表达关键词　

中图分类号　Q936　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)30-09467-03ConstructionandCharacterizationofRecombinantProkaryoticVectorpGEX24T21/γ2ggtXUJun2fengetal　(CollegeofLifeScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing,Jiangsu210046)Abstract　TodesignandconstructanprokaryoticexpressionvectorpGEX24T21/γ2ggt,andtoexpressEscherichiacoliγ2glutamyltranspeptidase,theBglⅡandXhoⅠsiteswereincorporatedintotheγ2ggtencodingfragmentbyPCR.AfterdigestingwithBglⅡandXhoⅠ,theγ2ggtencodingfragmentwasclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpGEX24T21atthecorrespondingBamHⅠandXhoⅠsites.ThepositiveclonesselectedwithPCRsequencedandtheex2pressionofγ2ggtinE.coliBL21(DE3)wasanalyzedwithSDS2PAGEafterinducedby1g/Llactosefor1to9hours.(DE3)harboringpGEX24T21/γ2ggtbegantoexpresstheγ2glutamyltranspeptidaseafter1hourinductionandkeptituntil6hwhenthetargetproteinreachedamaximum.NodegradationofproducedproteinwasobservedintheE.cells.T2mostlyinin2clusivebodiesandidentifiedbyWesternblotting.TheE.coliγ2ggtencodingfragmentvectorpGEX24T21andthiswasconfirmedbyPCRandsequencing.WesternblottinganalysisindicatedproteinwasfullyexpressedinE.coli.Itwilllayafoundationforfurtherstudyonbiosynthesisfunctionsofγ2glutamylγ2glutamyltranspeptidase;Clone;ProkaryoticexpressionKeywords　

　　,,[1]。,利用微生。广泛存在于微生

γ物中的γ2谷氨酰转肽酶(γ2glutamyltranspeptidase,2GGT,EC

2.3.2.2)具有转移γ2谷氨酰基团作用,可以将谷氨酰胺上γ2

[2-3]

(Acr)及甲叉双丙烯酰胺(Bis)购自Promega公司;四甲基乙二胺(TEMED)购自BioRad公司;考马斯亮蓝R2250购自

sanland公司;其余试剂均为国产分析纯。1.2　实验方法

γ1.2.1　引物设计与合成。根据NCBI公布的大肠杆菌k2122谷氨酰转肽酶基因序列设计引物,P1:5′2CGGCAGATCTATGA2

TAAAACCGACG23′,P2:5′2AGGTCTCGAGTTAGTACCCCGCC2GTTAAATC23′其中P1的5′端引入BglⅡ酶切位点,P2的5′端

谷氨酰基转移到乙胺受体上,催化合成茶氨酸。为了提高

微生物中γ2谷氨酰转肽酶的表达量,笔者从大肠杆菌k212中克隆出γ2ggt基因片段,转入原核表达载体pGEX24T21中,构建了重组质粒pGEX24T21/γ2ggt,并将其转化至大肠杆菌BL21

(DE3)中,以廉价、无毒的乳糖作为诱导剂,测定目的蛋白的

[4]

引入XhoⅠ酶切位点。以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

γα菌液为1.2.2　2ggt基因的扩增及鉴定。以大肠杆菌DH5α模板,直接PCR扩增ggt基因的序列。PCR反应体系:DH5

菌液1μl,10×PCRBuffer5.0μl,Mg2+2mmol/L,p1/p2各1.0μl,dNTP4.0μl,Taq酶0.5μl,超纯水补足50.0μl。PCR循环参数:94℃180s预变性;94℃40s,54℃45s,72℃120s,共30个循环;72℃延伸300s。取扩增产物1.0μl,于1%琼脂糖凝胶中电泳30min,电压强度5V/cm,凝胶成像分析系统观察结果。

1.2.3　连接与转化。PCR扩增的γ2谷氨酰转肽酶基因经胶

表达特性,为进一步将该酶应用于生产奠定基础。

1　材料与方法1.1　实验材料

α及1.1.1　菌株和质粒。质粒pGEX24T21,大肠杆菌DH5

BL21(DE3)均为实验室保存。

1.1.2　抗体与主要试剂。Anti2GSTpolyclonalantibody购自Novagen公司,IRDye800ConjugatedAffinityPurifiedAnti2MouseIgG(GOAT)购自Rockland公司;Taq酶,T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;限制性内切酶XhoⅠ,BamHⅠ,BglⅡ购自NEB公

回收试剂盒抽提纯化后,用BglⅡ和XhoⅠ37℃双酶切过夜,载体pGEX24T21用BamHⅠ和XhoⅠ37℃双酶切过夜,酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收;将回收的目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合,16℃连接过夜,构建含有目的基因的重组质粒pGEX24T21/γ2ggt,Ca2

α。Cl2法转化大肠杆菌DH5

1.2.4　重组质粒pGEX24T21/γ2ggt的筛选与鉴定。挑取单个

司;小提质粒试剂盒购自Sigma公司;胶回收试剂盒购自

Promega公司;蛋白胨和酵母粉购自英国OXOID公司;卡那霉

素、氨苄青霉素购于Ameresco公司;IPTG购自Merck公司;丙

基金项目　国家教育部基金项目(2002SWXSBJBC22)。

作者简介　胥俊峰(1980-),男,江苏东台人,硕士研究生,研究方向:生

物化学与分子生物学。

收稿日期　2007207207

菌落于含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜后,小提质粒,以p1/p2为引物,以抽提的质粒为模板进行