siRNA 非病毒 递送载体 现状

杨飞飞等: siRNA非病毒递送载体的研究现状

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胺作用, 甲壳胺分子上的乙酰基脱去生成CS, CS无皮肤刺激性和黏膜刺激性, 口服安全无毒。CS具有生物黏附性, 可生物降解, 有良好的生物相容性和安全性, 并且较容易修饰, 因而成为研究较为广泛的基因递送载体。CS可以递送包括DNA、siRNA和寡核苷酸在内的核酸分子。生理条件下, CS链上质子化的氨 基可以与带负电的siRNA相互作用, 进而穿细胞膜内吞进入细胞。CS免疫原性低, 能压缩siRNA保护其免受酶降解。Howard等[37]研究发现小鼠腹腔注射CS/siRNA复合物后, 能沉默全身巨噬细胞中肿瘤坏死因子的表达, 进而缓解全身及局部炎症。另有研究将GFP (green fluorescent protein)-转基因小鼠鼻内给予CS/siRNA复合物后, 可以沉默小鼠细支气管上皮细胞中GFP基因的表达[38]。Ghosn等[39]用PEG化的咪唑修饰CS后制备了siRNA的纳米粒 (chitosan- imidazole-4-acetic acid [IAA]-siRNA)。该纳米粒经静脉或鼻腔给药后均能实现基因沉默。按1 mg·kg 1 siRNA经静脉给药后能有效降低肺和肝脏的三磷酸甘油脱氢酶 (GAPDH) 的活性。其沉默效果与肝脏的载脂蛋白B之间存在剂量依赖性。最近有研究者将维生素E的琥珀酸盐偶联不同分子量的水溶性寡聚壳聚糖得到两亲性的α-生育酚-寡聚壳聚糖。该产物能自组装形成类脂质体的单层囊泡, 与siRNA复合后单分子层明显增厚。比较发现4 kDa的寡聚壳聚糖能显著增加siRNA的细胞摄取率 (>98%), 且抑制

在血清中保持稳定。Kim等[47]将siRNA和PEG通过二硫键形成络合物, 再与阳离子PEI相互作用制备聚电解质胶束。在类似细胞质的条件下, siRNA能完好地从络合物中释放。在最佳的条件下, 胶束比复合物有更强的基因沉默作用。 3.2.4 阳离子肽段

各种细胞穿膜肽包括源自HIV-1的TAT、MPG穿膜肽和聚精氨酸已经用于装载核酸和蛋白递送至靶细胞。细胞穿膜肽 (cell-penetrating peptides, CPP) 也被称为蛋白转导域 (PTD), 是几十年前从HIV-1 Tat 蛋白中发现的, 在逆转录HIV-1时发现能够自行穿越细胞质膜。其肽片段为49～59个氨基酸, 含有高密度的基本氨基酸 (精氨酸或赖氨酸), 能与质膜表面的负电荷相互作用提高肽段的内化。

3.2.4.1 共价结合的CPP-siRNA “Tat肽”是一 种结构明确的细胞穿膜肽。Chiu等[48]将Tat-肽N-末端半胱氨酸与siRNA反义链用3'-氨基连接构建了Tat-siRNA共聚物。加入细胞培养介质中, 可以诱导RNA; 实现外源基因EGFP和内源基因CDK9的沉 默, 亚细胞在核周围呈点状分布。这说明大部分Tat-siRNA定位于内涵体中。2007年有报道用HPLC法纯化CPP-siRNA共聚物后测定其RNA干扰效 浓度为10 μmol·L 1时对p38的表达的抑制 果[8, 49, 50]。

(20%～60%) 效果提高了2倍。RGD肽段是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp) 的小分子多肽, 与整合素ανβ3受体有高度的选择性和亲和力。将含有不同数目单体的RGD (cRGD) 与荧光素酶 (luciferase) 修饰的siRNA (Luc-siRNA) 偶联得 到聚合物cRGD-siRNA。人黑色素瘤细胞 (M21+) 对其细胞摄取、亚细胞分布及药理效果进行检测。结 果显示M21+的摄取受受体介导, 而未连接cRGD的siRNA则观察不到明显的受体介导[51]。胆固醇连接9-聚精氨酸肽段 (9R) 后可以将siRNA递送至小鼠体内移植瘤, 该模型中将能与特异性细胞表面连接的肽段或抗体片段连接到9R肽段上, 与肽段聚合后产物有细胞特异性; 与抗体聚合可以在配体与细胞受体结合后实现siRNA内化[52]。Wang等[53]将八聚 精氨酸 (R8) 与PEG化磷脂脂质体偶联, 修饰后的脂质体在10%血清存在的培养基中其转染效率和抑

靶蛋白表达的效果优于市售的Lipofectamine 2000。动物实验表明该产物可以有效沉默小鼠体内Mcl-1的表达, 抑制肿瘤细胞生长[40]。

环糊精 (cyclodextrins, CD) 也已经开发为siRNA递送的载体。环糊精无免疫原性, 因而在基因靶向递送系统中受到广泛的关注。在递送质粒DNA方面已有较多的研究, 而在siRNA的递送方面研究并不多[41 43]。Boe等[44]利用一种光化学内化技术 (photochemical internalization, PCI) 制备了环糊精- siRNA复合物 (CDP-siRNA)。结果表明, 优化后的PCI处方可以沉默80%～90%的siRNA表达, 产物从

核内释放5 h后显示最大的基因沉默效应。

另一个成功用于siRNA递送的生物相容性材料是端胶原。端胶原/靶向雄激素受体的siRNA复合物Itaka等[46]可以有效抑制人体内前列腺癌细胞生长[45]。合成了一种新型聚合胶束材料, 是含二氨基侧链的PEG-阳离子嵌段共聚物, 可与siRNA通过静电力形成聚合阴离子胶束, 简称PIC胶束, 这种胶束可以通过内涵体的缓冲能力提高siRNA细胞内活性, 可以

制肿瘤细胞的能力强于Lipofectamine 2000, 毒性低于Lipo 2000, 实现了对靶基因的沉默。

3.2.4.2 非共价结合的CPP-RNA复合物 将siRNA通过静电作用与CPP结合是简单有效的方法, 但是需要过量的CPP才能形成CPP/siRNA复合物大分子,