siRNA 非病毒 递送载体 现状

杨飞飞等: siRNA非病毒递送载体的研究现状

· 1437 ·

的有效方法。siRNA在治疗中非常有潜力。RNA干扰是伴随翻译而不是转录, 因此不会干扰染色体DNA, 减小了DNA基因治疗中可能产生的基因突变。siRNA发挥治疗作用是通过与mRNA相互作用而不是蛋白, 减少了合成前可能生成的有害蛋白; siRNA作为治疗药物的另一个优点是可以对很多蛋白实现基因沉默而治疗疾病。传统化学药物的靶点局限于特定的受体、离子通道和酶; 生物药如单克隆抗体或者细胞因子类主要是递送到细胞表面或者血液中; 而siRNA药物可以靶向任何感兴趣的mRNA上, 而不用考虑转录蛋白的细胞定位。另外, 只需要很少量的siRNA就可以实现基因沉默。 1 RNAi的作用特点

引发有效RNAi的dsRNA (长链双链RNA) 长度一般在21～23 bp, 长度>30 bp的dsRNA会引起细胞

成大分子在输送过程中的滞留、减缓甚至中断药物 输送。siRNA到达靶细胞后, 还必须经过有效内吞、摄取、同时保持RNAi完整性及活性才能发挥作用。复合物从内涵体逃逸至细胞质的过程中如果被低pH、可降解的内涵体膜阻挡则不能到达细胞质发挥作用。 3 siRNA的递送

3.1 化学修饰的siRNA直接递送

siRNA双螺旋的修饰方法有很多: 核糖修饰、磷酸链修饰、碱基修饰、突触和末端修饰和双螺旋结 构修饰等。化学修饰后可以改善siRNA血浆稳定性、提高效价、调节免疫活性、降低脱靶效应。Morrissey等[7]将siRNA和血清一起孵育, 分别用2-F、2-O-Me和2-H取代2-OH并结合到磷硫酰基末端, 可以明显延长siRNA的半衰期, 体内同样表现出较长的半衰期。Song等[8]利用抗体Fab片段与鱼精蛋白制备了 融合蛋白。该融合蛋白与siRNA分子复合物注射后, siRNA能进入靶组织细胞质, 沉默靶基因的表达, 抑制HIV病毒复制或肿瘤细胞增生, 证明是一种细胞特异性的给药系统。而裸siRNA分子则不能被靶组织细胞摄取。Southchek等[9]将2-O-Me修饰的抗载 脂蛋白B (apolipoprotein B, apo B) siRNA分子与胆固醇分子共价连接, 可显著降低小鼠体内apo B mRNA、总胆固醇水平和血浆apoB的含量; 同时siRNA分子的半衰期也显著延长。 3.2 载体递送

裸siRNA在生物体内容易被核酶 (RNase) 降解, 半衰期短, 转染效率低。因此, 稳定性对于siRNAs发挥阻抑作用至关重要[10]。病毒载体是最早用于体内递送siRNA的载体, 由于病毒载体在基因治疗实验中出现一些毒副作用和潜在的免疫原性、致瘤性等问题, 目前病毒载体已非siRNA首选递送方式。良好的递送载体可以提高siRNAs的稳定性和靶向性。 3.2.1 适合siRNA递送的载体要求

3.2.1.1 载体的稳定性 载体要满足一定的稳定性, 才能保护核酸在被细胞摄取前不受酶降解。物理稳 定性可以通过调节静电作用或者空间稳定作用减小纳米粒聚集而实现。在生理盐浓度和高聚电解质的 条件下, 静电稳定性是较难解决的。siRNA与聚合 物的稳定复合是保护其免受核酸降解成功递送的关键[2]。可以通过调节亲水性/疏水性, 聚合物分子量, 电荷密度等以优化与DNA的复合; N/P比值、pH和介质也都影响DNA与聚合物的静电结合。同时复合物要对内涵体敏感才能使得聚合物包衣破裂释放 核酸。

非特异性和基因表达受抑制与凋亡[3]; RNAi作用的发挥是通过降解靶mRNA来封闭目的基因表达, 发挥效应的时间是在转录后; siRNA具有高度的序列特异性, 任一碱基的错配均会导致RNAi效应的丧失, 因此其靶向性强; 同时在RNAi的级联放大效应及RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) 的作用下, 只需要极少量dsRNA便可降解自身浓度几倍甚至几并且siRNA可在RdRp的作用下大十倍的mRNA[4]。

量扩增, 并转运出细胞, 在不同细胞间长距离传递和维持, 使RNAi扩散到整个机体并可以传代; siRNA相对较稳定, 以3'-端悬垂TT碱基的siRNA尤为稳定, 在细胞中可稳定存在3～4天, 半衰期远长于反义寡核苷酸[5]。

2 siRNA递送的体内障碍[6]

体内注射后, 复合物必须在流经循环系统时避免肾滤过, 吞噬细胞摄取, 血清蛋白的凝聚和内源性核酸酶的降解才能到达靶细胞。siRNA在血清中稳定性较差, 易被RNase降解。吞噬作用是血流和细胞外基质中都存在的免疫障碍。吞噬细胞可以清除外来异物, 保护自身免受外来侵害,然而也可以清除体内某些治疗性大分子和纳米复合物。因此, 设计药物载体时要尽量想办法避免调理素的作用。从血管流出和跨越血管内皮是将siRNA递送至体内许多组织的主要障碍。一般而言, 直径>5 nm的分子由于不能跨越毛

细血管内皮而留在血液循环中。然而, 肝、脾和某些肿瘤组织等允许直径约200 nm的粒子通过, 因此, 纳米输送系统足以通过此类组织。

siRNA复合物进入血管后需要通过由致密网状多糖组成的细胞外基质和纤维蛋白, 该过程可能造