实验三

扫描电子显微镜样品制备及 其观察

College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity

一、实验目的听取电子显微镜的有关介绍，了解扫描电子显微镜 听取电子显微镜的有关介绍， 的基础知识。 的基础知识。 观摩扫描电镜生物样品制备技术演示， 观摩扫描电镜生物样品制备技术演示，了解对扫描 电子显微镜生物样品的基本要求、制备方法及过程。 电子显微镜生物样品的基本要求、制备方法及过程。 了解常规扫描电子显微镜样品制备过程及原理。 了解常规扫描电子显微镜样品制备过程及原理。

二、实验原理电子显微镜是以短波长的电子束为照明源， 电子显微镜是以短波长的电子束为照明源，用电 磁透镜成像，并与特定的机械装置、电子和高真空技 磁透镜成像，并与特定的机械装置、 术相结合所构成的现代化大型精密电子光学仪器。 术相结合所构成的现代化大型精密电子光学仪器。 扫描电子显微镜简称扫描电镜， 扫描电子显微镜简称扫描电镜，是用电视的 方式成像，用极狭窄的电子束去扫描样品， 方式成像，用极狭窄的电子束去扫描样品，即电子束 在样品上做光栅运动。 在样品上做光栅运动。电子束与样品作用将会产生各 种效应，其中主要是样品的二次电子发射， 种效应，其中主要是样品的二次电子发射，二次电子 能产生样品表面放大的性貌像，这个像是样品在扫描 能产生样品表面放大的性貌像， 时时序地建立起来的， 时时序地建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放 大的像。 大的像。

(一)扫描电子显微镜的特点扫描电子显微镜特点是景深长，图像层次丰富， 扫描电子显微镜特点是景深长，图像层次丰富， 立体感强，为三维结构图像。样品制作简单， 立体感强，为三维结构图像。样品制作简单，不必做 超薄切片，且能观察大而后的样品， 超薄切片，且能观察大而后的样品，因此应用范围较 可以广泛应用于生物、 广，可以广泛应用于生物、非生物样品的表面及其断 面立体形貌的观察。 面立体形貌的观察。

(二)扫描电子显微镜的结构及作用

扫描电子显微镜主要由电子光学系统和显示单元 组成。 组成。 电子光学系统：电子光学系统由电子枪、 电子光学系统：电子光学系统由电子枪、几个磁透 扫描线圈以及样品室组成( 镜、扫描线圈以及样品室组成(实际上相当于透射 电镜的照明系统，它不需要成像系统)。 电镜的照明系统，它不需要成像系统)。 显示单元：显示单元包括信号的收集、放大、处理、 显示单元：显示单元包括信号的收集、放大、处理、 显示与记录(即照相)部分。 显

示与记录(即照相)部分。

(三)扫描电子显微镜的样品制备方法及过程1.扫描电子显微镜的样品制备方法 表面复型法：该法是用碳、 (1)表面复型法：该法是用碳、硅或火棉胶液的薄膜将标本 的表面拓印下来，再在透射电镜观察印在薄膜的精细结构。 的表面拓印下来，再在透射电镜观察印在薄膜的精细结构。 此法常用于观察细胞或组织的表面结构。 此法常用于观察细胞或组织的表面结构。 冰冻蚀刻法：此法是先将样品快速冻结， (2)冰冻蚀刻法：此法是先将样品快速冻结，然后在真空喷 镀仪中用冷刀切小削样品，使其暴露细胞的内部结构， 镀仪中用冷刀切小削样品，使其暴露细胞的内部结构，待切 面的冰在真空下升华后，表面喷镀铂碳膜，制成表面复型膜。 面的冰在真空下升华后，表面喷镀铂碳膜，制成表面复型膜。 从真空取出后，放在蒸馏水中剥离出复型膜， 从真空取出后，放在蒸馏水中剥离出复型膜，再置入浓硝酸 中将残留的样品溶解，经蒸馏水漂洗后打捞于铜网上， 中将残留的样品溶解，经蒸馏水漂洗后打捞于铜网上，待干 后于电镜下观察。此法常用于观察细胞内部结构， 后于电镜下观察。此法常用于观察细胞内部结构，得到的为 生动的立体浮雕图像。 生动的立体浮雕图像。

2.扫描电子显微镜的样品制备过程 由于观察目的不同， 由于观察目的不同，除了使用相同的固定液 外，扫描电子显微镜生物样品制备与透电子显微镜 射有较大的差异。为了得到无损、 射有较大的差异。为了得到无损、真实而清晰的表 面形貌结构， 面形貌结构，在扫描电子显微镜样品制备的全过程 中都必须十分小心地保护被观察面， 中都必须十分小心地保护被观察面，因此在二次电 子表面形貌成像工作状态下， 子表面形貌成像工作状态下，必须满足下述四项基 本要求： 本要求： 样品的被观察面应充分的暴露出来( ①样品的被观察面应充分的暴露出来(在所 要求的二次电子图像分辨率水平上),无污染、 ),无污染 要求的二次电子图像分辨率水平上),无污染、无 皱缩、无明显的人工损伤及附加结构。 皱缩、无明显的人工损伤及附加结构。

②镀一层均匀的重金属导电材料(金、铂、钯铱和金等), 镀一层均匀的重金属导电材料( 钯铱和金等), 造成被观察表面的“质量—密度 一致性。 厚度” 密度” 造成被观察表面的“质量 密度”一致性。“厚度”即要大 于等于入射点子束进入样品的扩散深度， 于等于入射点子束进入样品的扩散深度，又不能掩盖样品本 身的凹凸形貌结构。同时，样品表面的二次电子发射率要高

。 身的凹凸形貌结构。同时，样品表面的二次电子发射率要高。 样品、样品与样品托之间导电性要好。 ③样品、样品与样品托之间导电性要好。 能耐受高能量的入射电子和高真空，不变形、不升华。 ④能耐受高能量的入射电子和高真空，不变形、不升华。

在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求， 在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求，采 取不同的技术，使被观察表面充分地暴露出来；脱水时， 取不同的技术，使被观察表面充分地暴露出来；脱水时， 为了避免观察表面皱缩变形，设计了特殊的干燥方法； 为了避免观察表面皱缩变形，设计了特殊的干燥方法； 此外，还必须对样品进行导电处理， 此外，还必须对样品进行导电处理，在样品表面喷镀一 层厚度适当、均匀的金属膜。 层厚度适当、均匀的金属膜。

三、实验仪器、材料和试剂 实验仪器、1.仪器、用具：临界点干燥器、离子溅射仪、超声波 仪器、用具：临界点干燥器、离子溅射仪、 清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、抛光膏、 清洗机、电吹风机、磁力搅拌器、干燥器、抛光膏、刀 剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、牙签、竹签、 片、剪刀、镊子、样品盒、酒精灯、牙签、竹签、培养 烧杯、量筒、量杯、注射器、载玻片、脱脂棉、 皿、烧杯、量筒、量杯、注射器、载玻片、脱脂棉、导 电胶。 电胶。 试剂：2.5%戊二醛溶液 戊二醛溶液、 溶液、 2.试剂：2.5%戊二醛溶液、1% OSO4溶液、0.2mol/L PBS溶液 醋酸异戊酯、液体CO 双蒸水。 溶液、 PBS溶液、醋酸异戊酯、液体CO2、双蒸水。 材料：生物样品(植物花粉、昆虫口器和附肢) 3.材料：生物样品(植物花粉、昆虫口器和附肢)

四、实验内容1.观摩学习扫描电子显微镜的样品的制备制备方 法及基本过程。 法及基本过程。 学习扫描电子显微镜下观察样品。 2.学习扫描电子显微镜下观察样品。 观看扫描电镜照片， 3.观看扫描电镜照片，了解各种不同生物体细胞 的表面空间结构。 的表面空间结构。

五、实验方法与步骤在老师的指导下学习扫描电子显微镜的样品的制备 制备方法及基本过程， 制备方法及基本过程，并用扫描电子显微镜观察生物 样品。扫描电子显微镜的样品的制备制备的基本过程： 样品。扫描电子显微镜的样品的制备制备的基本过程： 准备样品托：用抛光膏擦净样品托， 1.准备样品托：用抛光膏擦净样品托，然后用 丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。 丙酮洗净抛光膏，电吹风吹干备用。 取材：注意保护好被观察表面， 2.取材：注意保护好被观察表面，彻底清洗干 暴露出最佳位置

。 净，暴露出最佳位置。样品体积应依据观察要求及样 品托大小等酌情而定。 品托大小等酌情而定。

3.固定、漂洗和脱水：由于扫描电子显微镜是观察样 固定、漂洗和脱水： 品某一表面形貌的，所以固定时间可以比TEM TEM短 品某一表面形貌的，所以固定时间可以比TEM短。 另外，脱水时，到纯乙醇级即可。漂洗可参考TEM 另外，脱水时，到纯乙醇级即可。漂洗可参考TEM 样品制备。 样品制备。 用醋酸异戊酯置换乙醇：弃去乙醇， 4.用醋酸异戊酯置换乙醇：弃去乙醇，用醋酸异戊酯 与纯乙醇1 的混合液浸10~20min 10~20min。 与纯乙醇1:1的混合液浸10~20min。弃去混合液进 入纯醋酸异戊酯， 10~20min。 入纯醋酸异戊酯，浸10~20min。

置换醋酸异戊酯及临界点干燥： 5.CO2置换醋酸异戊酯及临界点干燥：从纯醋酸异戊酯中取 出样品，保持湿状态时置入临界点干燥仪(critical 出样品，保持湿状态时置入临界点干燥仪(critical point 的样品盒并放入样品室(预冷)。盖紧样品室， )。盖紧样品室 dryer) 的样品盒并放入样品室(预冷)。盖紧样品室，充 入液体CO 液面高出盒面。缓慢排出气体CO 气体。 入液体CO2,液面高出盒面。缓慢排出气体CO2气体。直至样 品保持湿润、周围有少量液体CO 为止。重复充液排气2~3 2~3次 品保持湿润、周围有少量液体CO2为止。重复充液排气2~3次。 然后，向样品盒内注入液体CO 高度不超过80%),加热 80%),加热、 然后，向样品盒内注入液体CO2(高度不超过80%),加热、 加压、排气。取出样品放入干燥器内备用。 加压、排气。取出样品放入干燥器内备用。临界点干燥是利 用水和气的临界状态下表面张力为零的特性， 用水和气的临界状态下表面张力为零的特性，使样品中的液 体气化而干燥，避免了表面张力对结构的破坏。 体气化而干燥，避免了表面张力对结构的破坏。

6.黏贴样品：用少量导电胶涂在样品托上，用镊子轻夹样 黏贴样品：用少量导电胶涂在样品托上， 品侧面，观察面朝上置于样品托上。 品侧面，观察面朝上置于样品托上。 离子溅射镀膜： 7.离子溅射镀膜：把样品托插入离子溅射仪真空实样品 台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层10~15nm 10~15nm厚的金 台上，操作溅射仪，可使样品表面覆盖一层10~15nm厚的金 属膜。溅射镀膜的基本原理是，高能粒子轰击金属靶( 属膜。溅射镀膜的基本原理是，高能粒子轰击金属靶(金、 钯铱和金等), ),靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉 铂、钯铱和金等),靶金属原子获能后由靶表面逸出而沉 积在样品表面，形成连续的导电膜。 积在样品表面，形成连续的导电膜

。这种金属膜不仅可以 导电，受激产生较强的二次电子发射， 导电，受激产生较强的二次电子发射，而且使样品表面具 质量—厚度 的一致性。严格地控制膜的厚度， 厚度” 有“质量 厚度”的一致性。严格地控制膜的厚度，是获 得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。 得清晰、真实的二次电子表面形貌成像效果的重要条件。

六、实验结果在扫描电子显微镜下， 在扫描电子显微镜下，可以看到各种生物 样品的表面及其断面立体形貌。 样品的表面及其断面立体形貌。

七、实验注意事项1.为了得到无损、真实而清晰的表面形貌结构，在SEM样 为了得到无损、真实而清晰的表面形貌结构， SEM样 品制备的全过程中都必须十分小心地保护被观察面。 品制备的全过程中都必须十分小心地保护被观察面。 在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求， 2.在取材时，针对不同的样品、不同的观察要求，采取不 同的技术，使被观察表面充分地暴露出来； 同的技术，使被观察表面充分地暴露出来； 脱水时，为了避免观察表面皱缩变形， 3.脱水时，为了避免观察表面皱缩变形，要设计特殊的干 燥方法； 燥方法； 4.必须对样品进行导电处理，在样品表面喷镀一层厚度适 必须对样品进行导电处理， 均匀的金属膜。 当、均匀的金属膜。

八、实验作业1.简述扫描电镜的工作原理。 简述扫描电镜的工作原理。 2.比较透射电镜和扫描电镜的特点及适用范围。 比较透射电镜和扫描电镜的特点及适用范围。 3.指出在扫描电子显微镜下观察生物样品有什么基本 要求？ 要求？