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第10期

袁铁铮等:分子水平上益生菌研究进展

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表2 在乳酸菌中表达外源基因使用的启动子Table2 Characteristicsofinduciblepromoters

forexpressinggenesinLAB

启动子PromoterlacA lacRnisA nisFtrpEpal70

说明

Relevantproperties

来源于ctis,诱导型启动子,诱导物是乳糖来源于ctis,诱导型,诱导物是nisin来源于ctis,诱导型启动子,限制色氨酸诱导型启动子,低温或低pH启动表达

脱氢酶(LDH,lactatedehydrogenase)降解丙酮酸,产生乳酸,引发D 乳酸中毒,如果能得到不产生乳酸脱氢酶的乳酸菌就能解决乳酸中毒症的问题,目前已经得到植物乳杆菌L.plantarum、瑞士乳杆菌L.helveticus、约氏乳杆菌L.johnsoniiLa1乳酸脱氢酶缺陷型菌株(ldhD)

-[17]

。

2 3 报告系统

报告系统能够对菌体细胞代谢进行动态监测,建立报告系统首先要将报告基因(见表3)转化到益生菌中,筛选得到表达报告基因的重组菌株,把报告基因的产物作为生化标记,通过检测这些生化标记,监测益生菌生长繁殖情况、益生菌基因表达情况、与宿主和有害微生物之间的相互作用等。

2 2 2 对内源基因的遗传修饰 对益生菌染色体上内源基因的遗传修饰主要指敲除有害基因,构建缺陷型菌株,或者改造功能性的内源基因,筛选

更为优良的益生菌菌株。报道比较多的是对乳酸杆菌进行遗传修饰,研究表明乳酸杆菌在儿童体内帮助调控肠道菌群,但是许多乳酸菌能够产生乳酸

表3 用于益生菌体内监测的报告基因

Table3 Reportergeneformonitorinprobioticsorganisms

报告基因Reportergenes

cat 194(Staphylococcusaureus)gusA(E.coli)

lacL lacM(Leuconostocmesenteroides)amyL(Bacilluslicheniformis)luxAB(Vibriofischeri)nuc(S.aureus)gfp(Aequoreavicoria)

基因产物Expressedproduct氯霉素乙酰转移酶 葡糖醛酸酶 半乳糖苷酶 淀粉酶荧光素酶核酸酶绿色荧光蛋白

参考文献ReferencesAchenetal,1986Christetal,1994Hansetal,1995Pascaletal,1992Eatonelal,1993Poquetetal,1998Martinetal,1994

用作报告基因的gfp基因编码绿色荧光蛋白GFP,检测时不需要外源底物或辅因子,可以监测基因表达和在活细胞里定位蛋白质,实现在消化道内实时监测GFP菌株的代谢情况。已经在小

鼠内使用GFP作为生化标记,通过乳酸菌表达gfp基因,利用流式细胞计量术,对发荧光的乳酸菌计数,监测乳酸菌的生命活动,分析乳酸菌与不同细胞的相互作用,到目前GFP系统已经被成功地应用于Mycobacteriumbovis、Streptococcusthermophilcus、Lactococcuslactis、Lactcoccusplantarum等多种益生菌。

2 4 安全性

虽然目前对益生菌安全性并没有公认的解释,但综合目前对益生菌的研究对益生菌安全性可以获得如下的认识:益生菌一定不能是致病菌而且不能产生有害物质,菌株不能通过遗传修饰获得有害基因或者具有把有害基因转移的潜力,这里的有害[20]

[9]

+

[18,19]

耐药性是筛选益生菌的一个重要指标,许多微生物自身存在抗某些抗生素的抗性基因,一方面益生菌只有对抗菌物质具有一定耐受性才能在消化道内存活,另一方面益生菌因为具有抗性而成为耐

[21~23]

药性的病原体,就会导致一些临床问题。通常肠道球菌Enterococcusfaecalis和E.faecium对万古霉素(vancomycin)敏感,但是陆续从抗性菌株分离到了抗性基因van基因,还发现一些肠道球菌能够获得van抗性基因。甚至还发现一些乳酸菌,如Lactobacillus、Pediococcus、Leuconnostoe、L.rhamnosus等自身存在包括抗万古霉素的一些抗性基因,但这些基因与van基因没有同源性,也没有证据表明乳酸菌会把抗性基因转移到其它微生物当中

[24]

。

值得注意的是益生菌株如果含有可转移的耐药性因子,那么对宿主生物体安全是有害的。目前认为由于基因转移获得致病基因可能是造成益生菌转变成有害菌的一个重要因素。肠道球菌被认(