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中 国 生 物 工 程 杂 志第24卷

对益生菌作用机理的研究,主要包括消化道内微生物菌群的动态变化、菌体细胞的代谢、菌群与宿主免疫系统的关系、菌群对宿主代谢的影响等方面,开始关注益生菌使用的安全性,结合益生菌功能基因组学研究,对细胞内基因的表达和调控进行研究。下面概述一下在分子水平上研究益生菌的一些研究进展。

2 1 菌株的分离与鉴定

动态的、完整的描绘整个消化道内微生物的分布和组成,对于正确评价益生菌在细胞水平上的营养调控机制和评价益生菌制剂的质量具有重要意义。应用分子生物学的方法,能够根据益生菌基因组DNA序列的特异性,进行群间、属间、种间、亚种间、乃至菌株之间的鉴定,帮助从复杂的培养物中间分离菌株。

帮助鉴定益生菌的分子生物学方法主要包括基因组探针技术和基因组指纹技术(如RFLPs技术、RAPD技术和AFLPs技术)。探针技术与生物芯片技术结合,能够从复杂微生物环境中快速检出并追踪感兴趣的菌株,探针技术使用的探针包括核糖体寡核苷酸探针(一般是16SrRNA)、全染色体探针、根据基因组的特殊的序列设计的DNA片段、质

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粒DNA探针等。基因组指纹技术利用DNA片段长度的多态性,能够区分不同的菌株,帮助分析动态的、多样的微生物菌群。

另外PCR技术和其它技术联用为益生菌的研

究提供了有力的技术手段,PCR技术相对简单快速,不需要进行繁杂的微生物培养,利用专一性的引物,分析复杂菌群的菌种分布情况,检测染色体上是否存在致病因子的基因,帮助进行菌株鉴定。2 2 益生菌细胞的遗传修饰

利用基因工程技术改良已经过筛选或被证明有临床效果的菌株,拓宽它的应用范围,增强应用效果。与传统诱变方法相比,直接对染色体DNA定向操作更可能保持菌株原有的优良性状。这方面研究比较多的益生菌就是乳酸菌,归纳起来主要有两条技术路线:

2 2 1 利用益生菌作为体内生物反应器表达外源基因 目前芽孢杆菌、酿酒酵母和乳酸菌都可以作为表达外源基因的宿主菌,其中乳酸菌作为 体内生物反应器 最有代表性,也可能是最有价值的。表达的外源基因主要包括酶基因和治病 抗病基因,目前许多报道都集中在对促进消化的外源酶基因的克隆和表达(表1)。

表1 使用益生菌作为 体内生物反应器 表达外源基因

Table1 Heterologousgeneexpressedbyprobioticsorganismsas endo bioreactor

宿主菌Host

Lactococcuslactis

Lactobacillusgasseri、L.johnsoniiL.plantarumL.plantarumL.plantarumStreptococcilactisL.acidophilus

表达产物Expressedproduct脂肪酶内切葡聚糖酶 淀粉酶 淀粉酶内切葡聚糖酶 半乳糖苷酶 半乳糖苷酶

外源基因来源

SourceofheterologousgeneStaphylococcushyicusClostridiumthermocellumBacillusstearothermophilusBacillusamyloliquefaciensClostridiumthermocellumE.coliL.bulgaricus

文献ReferencesDrouaultetal,2002Jaie Soonetal,2000Scheirlincketal,1989Jonesetal,1990Batesetal,1989DeCosetal,1988Linetal,1996

另外随着对益生菌与免疫系统关系研究的深入,有人提出利用食品级的乳酸菌作为活疫苗,

或者把乳酸菌作为受体菌表达和运输抗原分子,但是尚未见成功应用的报道。

把益生菌作为表达外源基因的宿主菌,除了必须得到适合基因操作的菌株外,还必须建立合适的载体以及解决外源基因表达的相关问题,从目前的报道来看主要表现出以下一些特点:(1)目前受体

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菌主要使用乳酸菌,特别是乳酸乳杆菌;(2)构建表达载体的一些元件都来源于益生菌;(3)表达载体

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通常使用诱导型的启动子(见表2);(4)一些研究表明整合到染色体上的外源基因稳定性较高。其中使用nisA nisF启动子的乳酸菌表达系统是近些年发展起来的,表达过多种外源基因,进行诱导表达的诱导物是一种3 5kDa大小的抗菌肽!!!乳链菌肽nisin,可以在食品中使用。

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