《基因工程原理》

第四章 目的基因的制取

山东理工大学生命科学学院

目标基因剪接Kleismith & Kish (1995) Cell and Molecular Biology, p. 115

人类胰岛素 Human Insulin

基因接入载体 送入宿主细菌 挑出所要群落

Stryer (1995) Biochemistry, p. 119

探针 Probe互补 DNA 专一性抗体

得到纯系转殖菌株

大量培养生产

目的基因你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。研究某个基因，或者要克隆某个基因用于 生产大量DNA和蛋白质分子，首先都要把它从 庞大的基因组中分离出来。

目的基因需要克隆的DNA片段。

编码某种蛋白质研究某基因结构 和功能的关系

研究某基因与 疾病的关系

目的基因的克隆战略

一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库， 即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有 目的基因的重组克隆；

另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法 体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。

第四章 目的基因的制取

一 目的基因制取的基本策略

二 文库法三 化学合成法 四 PCR法

一、目的基因制取的基本策略1.选择含目的基因的实验材料

染色体DNA

由mRNA反转录而得到的cDNA

2.选择合适的方法制备DNA片段并克隆到分 子克隆载体 3.人工构建的重组体向寄主细胞内的转移

4.选择合适方法筛选目的基因

组织 DNA 部分或完全消化 cDNA DNA片 段 的 电泳分离

载体 (选择一种载体)

mRNA

待 克 隆 的DNA组织 DNA 部分或完全消化 cDNA DNA片 段 的 电泳分离 载体 (选择一种载体) 待 克 隆 的DNA 外 源DNA同 载体分子连接 重 组DNA导 入 大 肠 杆 菌 (体外包装或转化) 基因库的鉴定 阳性克隆的筛选 扩增长期储藏

外 源DNA同 载体分子连接 重 组DNA导 入 大 肠 杆 菌 (体外包装或转化) 基因库的鉴定

真 核 基 因 克 隆 的 基 本 步 骤

阳性克隆的筛选

扩增长期储藏

二 文库法制取目的基因

随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段或

cDNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。

(一)从基因组DNA文库获取目的基因组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片段 克隆载体 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克 隆载体所携带的所有基 因组DNA的集合

重组DNA分子 受体菌含重组分子的转化菌

1.染色体DNA的切断

超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。

全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不 可控

DNA的限制酶切基因组DNA的片段化a.不同的限制酶酶切基因组产生不同

长度的片段

b. 不同的限制酶酶切同一个基因组产生不同数目的DNA片段Four-base enzyme

Six-base enzyme

Eight-base enzyme

限制酶切位点cos L R cos

真核生物染 色体DNA

限制酶消化cos L 左臂

限制酶部分消化

除去中间片段

R cos 右臂

~20 Kb DNA 片段

外源DNA与载体DNA混合cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos

连接反应

体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌

基因文库