乳酸菌的分离与酸乳的制作

一、实验目的

(1)了解乳酸菌的生长特性和乳酸发酵的基本原理。

(2)学习酸乳的制作方法。

二、实验原理

酸乳是牛奶经过均质、消毒、发酵等过程加工而成的。酸乳的品种很多,根据发酵工艺的不同,可分为凝固型酸乳和搅拌型酸乳两大类。凝固型酸乳在接种发酵菌株后,立即进行包装,并在包装容器内发酵、成熟。凝固型酸乳经调配又可制作成为各种风味保健饮料。

嗜热乳酸链球菌和保加利亚乳杆菌是两类最常用的酸乳发酵菌种,近年来,双歧乳酸杆菌引入酸乳制造。双歧杆菌产生的双歧杆菌抑菌素对肠道中的致病微生物具有明显的杀灭效果,双歧杆菌还能分解积存于肠胃中的致癌物N—亚硝基胺,防止肠道癌变,并能促进免疫球蛋白的产生,提高人体免疫力,使酸乳在原有的助消化、促进肠胃功能的基础上,又具备了防癌和抗癌的保健效用。生产上已经由传统的单株发酵,变为双株或三株共生发酵。

乳酸菌种可以从市场销售的各类酸乳中分离。

三、实验器材

(1)菌种

嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌,乳酸菌种也可从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。

(2)培养基

BCG牛乳培养基(A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min；B液：酵母膏10g，水500ml，pH6.2,琼脂20g, 121℃湿热灭菌30min.以无菌操作趁热将A、B溶液混合后倒平板)；乳酸菌培养基（脱脂奶粉6%，乳糖2%，酵母膏1.5%,121℃湿热灭菌15min）；脱脂乳试管（脱脂奶粉6%，蔗糖4%，装入试管1/3,115℃灭菌15min）

(3)仪器、用具及其他

恒温水浴锅、酸度计、均质机、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶(200-280mL)、培养皿、试管、50mL、500mL三角瓶。

脱脂乳粉、全脂乳粉或鲜牛奶、蔗糖。

四、实验步骤

1.乳酸菌的分离纯化

(1)分离 取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5,其中的10-4、10-5 两个稀释度的稀释液各0.1-0.2mL,分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上,用无菌涂布器依次涂布,或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离,置40℃温箱中培养48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

(2)鉴别 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中,40℃培养8h,若牛乳出现凝固,无气泡,呈酸性,涂片镜检细胞杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入),革兰氏染色呈阳性,则可将其连续传代,最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管,保存待用。

2.乳酸发酵及检测

(1) 菌种扩大培养

将分离的2种菌种（嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌）各1环分别接种到装

有20ml乳酸菌培养基的50ml三角瓶中，40℃静置培养6h，按4%接种量在装有乳酸菌培养基480ml的500ml三角瓶中,同样条件下各自扩大培养1次。

(2) 乳酸发酵培养基的配制

将全（脱）脂乳、蔗糖和水以10∶5∶70(W/V)的比例充分混合,于60-65℃灭菌30min,然后冷却至40-45℃,作为制作饮料的培养基质。

如果以鲜牛乳为原料,由于牛乳中的乳脂率和干物质含量相对较低,特别是酪蛋白和乳清蛋白含量偏低,制成的酸乳凝乳的硬度不高,可能会有较多乳清析出。为了增加干物质含量,可用以下3种方法进行处理:

a.将牛乳中水分蒸发10%-20%,相当于干物质增加1.5%-3%;

b.添加浓汁牛乳(如炼乳、牦牛乳或水牛乳等);

c.按质量的0.5%-2.5%添加脱脂乳粉。

(3) 接种发酵

按各2%的比例接种接入到乳酸发酵培养基中混匀实行混菌发酵，同时按4%的比例接种接入到乳酸发酵基中混匀实行单菌发酵，发酵后比较单菌与混菌产品风味等方面的差异。发酵条件：40-42℃恒温箱中培养3-4h。培养时注意观察,在出现凝乳后即停止培养。然后转入4-5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段,达到酸乳酸度适中(pH4-4.5),凝块均匀致密,无乳清析出,无气泡,获得较好的口感和特有风味。

(4)乳酸含量的检测

定性法：硝酸银滤纸显色法。

定量法：显色法

注意事项

①采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时,注意挑取典型特征的黄色菌落, 结合镜检观察,有利高效分离筛选乳酸菌。

②制作乳酸菌饮料,应选用优良的乳酸菌,采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵, 使其具有独特风味和良好口感。

③牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间,防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测, 如大肠菌群检测等。经品尝和检验,合格的酸乳应在4℃条件下冷藏, 可保持6-7d。

④采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳比用单独一种菌发酵生产的酸乳香味和口感更佳。品尝时若出现异味(比如苦味),可能是由于无菌操作不规范而污染了杂菌。用过高温度灭菌也可能破坏乳酸风味。如选用的乳酸菌未能使牛乳凝固,则可能是由于所选菌落并非乳酸菌。另外,发酵时间过长或温度过高可能会造成乳清析出过多的现象。

五、实验结果及报告

将发酵酸乳的感官评价结果记录于下表中。记录发酵过程、检测结果并进行分析。

附1:乳酸饮料的制作

实验配方: 酸乳(经后酵) 300mL, 50度糖浆220mL, 食用柠檬酸1.5g, 耐酸型食用CMC 1.5g, 乳化发酵牛奶香精0.8mL, 乳化草莓香精1.0mL, 饮用水加至1000mL.

调配后用均质机在55~70℃和20MPa下均质,灌装、封口后, 85℃30min水浴消毒,冷却后, 4℃下可保存6个月。

附2: 乳酸含量的检测和乳酸菌的镜检

1 脱脂乳试管制作

直接选用脱脂乳液或按脱脂乳粉与5%蔗糖水1:10的比例配制,装量以试管的1/3为宜,115℃灭菌15min。

2 乳酸检测方法

2.1 乳酸的定性检验

打开发酵瓶盖,闻瓶中有无臭味;测定发酵液pH;吸取乳上清液约10mL于试管中,加入10% H2SO41mL,再加2% KMnO41mL,此时乳酸转化为乙醛,把事先在含氨的硝酸银溶液中浸泡的滤纸条搭在试管口上,微火加热试管至沸腾,若管口滤纸变黑,则说明有乳酸存在。

2.2 定量测定

2.2.1 测定方法:取稀释10倍的酸乳上清液0.2mL,加至3mLpH9.0的缓冲液中,再加入0.2mLNAD溶液,混匀后测定其OD340 值为A1, 然后加入0.02mL L(+)LDH, 0.02mL D(-)LDH, 25℃保温1h后测定OD340 值为A2。同时用蒸馏水代替酸乳上清液作对照,测定步骤及条件完全相同,测出的相应值为B1和B2。

2.2.2 计算公式:

乳酸/g(100mL)-1=(V×M ×lε×D) /(1000×ε×1×Vs)

式中:

V—比色液最终体积(3.44mL)

M —乳酸的克分子质量(90g/mol)

lε—(A2-A1)- (B2-B1)

D —稀释倍数(10)

ε—NADH 在340nm 吸光系数(6.3×103×1×mol-1×cm-l)

l—比色皿的厚度(0.1cm)

Vs—取样体积(0.2mL)

2.2.3 测定乳酸试剂的配制

3 酸乳的检查指标

3.1 感官指标:酸乳凝块均匀而细腻,色泽均匀,无气泡,有乳酸特有的悦味。

3.2 合格的理化指标:如脂肪≥3%, 乳总干物质≥11.5%,蔗糖≥5.00%, 酸度70~110T°, Hg<0.01×10-6 mg/mL等。

3.3 无致病菌,大肠菌群≤40个/100mL。

4 乳酸细菌的显微观察

4.1 取发酵液1滴,涂抹在干净的载玻片上,风干后在火焰上微微加热固定,用番红或结晶紫染色1min,流水冲洗,干燥。

4.2 在显微镜下,先用低倍镜、高倍镜,再用油镜观察,注意区分乳酸杆菌和乳酸链球菌。