实验四植物细胞骨架的制备与观察

实验四 植物细胞骨架的制备与观察

实验简介：细胞骨架对维持细胞形态、细胞生长、细胞运动、分裂、分化、信号传递、基因表达等方面起着十分重要的作用。本实验采用适量浓度的Triton X-100处理细胞时，可使细胞膜和细胞质中大部分蛋白质和脂质被溶解抽提掉，但细胞骨架系统蛋白质却不受破坏而被保存下来，经固定和染色后可在光镜下见到网状结构的细胞骨架。实验学时3个。

一、实验目的

1. 掌握考马斯亮蓝R250对植物细胞骨架染色的方法。

2. 通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态

观察。

二、实验原理

细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。

三、实验材料

(一) 材料 洋葱鳞茎若干

（二）器材 光学显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计 （三）试剂

1. 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)

0.2mol／L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3） 50ml 0.15mol/L NaCl 50ml 双蒸馏水 加至1000ml 2. PB

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0.2mol／L Na2HPO4 77 ml 0.2mol／L NaH2PO4 23 ml 3. M-缓冲液

咪唑(PH 6.7) 50mmol/L KCl 50mmol/L MgC12 0.5mmol/L EGTA 1mmol/L EDTA 0.1mmol/L 巯基乙醇 1mmol/L 甘油 4mmol/L 用1mol/L HCl调pH至7.2。

4. 1％的Triton X-100／M-缓冲液：实验前，取1ml Triton X-100，用M-缓

冲液配制成100ml，即可。 5. 0.2％考马斯亮蓝R250染液

考马斯亮蓝R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸馏水 46.5ml 6. 3%戊二醛溶液：用0.01mol/L PBS配制。

四、实验操作

见图？

取洋葱内皮1cm左右

置于含PBS液的载玻片上

湿润后，吸去PBS

加2滴1％Triton X—100／M—缓冲液，20～30min

实验四植物细胞骨架的制备与观察

吸去缓冲液，加3%戊二醛- PB溶液，固定20min

加PBS洗2次，共5min

加0.2％考马斯亮蓝R250染色10～20min

用PBS洗2次，共2～5min，吸干

镜检并绘图

图？ 细胞骨架标本制作过程

五、结果

在光学显微镜下，可见在细胞核和细胞质表面分布许多排列不规则的纤维束，走向清晰，呈浅蓝色或深蓝色。但实验中，也可见到部分细胞骨架纤维并非呈纤维状，而是呈串珠状或颗粒状，这是由于在固定和PBS洗涤过程中，并没有将溶解下来的膜蛋白等成分去除造成的。但由于考马斯亮蓝R250染色是一种非特异性反应，因此此实验尚不能区别微管、微丝和中间纤维。

六、注意事项

1. 用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理材料时，应控制在30min左右； 2. 每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。

3. 加3%戊二醛溶液对细胞骨架和细胞形态的维持十分重要，固定时间应

不低于20min。

七、作业

1. 画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。 2. 为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？

实验四植物细胞骨架的制备与观察

洋葱内皮细胞中的细胞骨架形态