酶联免疫吸附实验(ELISA)

1.

ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原 或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或 抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体 既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的 方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体 中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合 在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检 物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后， 底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进 行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间 接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很 高的敏感度。

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶 标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与 固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法(见 图)。

操作步骤如下： 1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。 洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2)加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异 抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。 经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清 中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体， 但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫 复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接 地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本 中受检抗体的量正相关。 4)加底物显色

本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病 的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用 粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽 可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注 意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例 如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有 E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的 抗E.Coli抗体发生反应。

抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例 如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的 Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原 中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效 果。

ELISA的试剂

在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂： 免疫吸附剂、结合物和酶的底物。

完整的ELISA试剂盒包含

以下各组分：(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂); (2)酶标记的抗原或抗体(结合物); (3)酶的底物； (4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中), 参考标准 品和控制血清(定量测定中); (5)结合物及标本的稀释液； (6)洗涤液； (7)酶反应终止液。

2.1 免疫吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8℃) 干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试 盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行 包被。以下简述固相载体和包被过程 :

2.1.1

固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和 容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材 料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较 强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附 其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格 低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制 成各种形式。

ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小 珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于 EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量 滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检 测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后， 大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测， 并可在特制的比色计上迅速读出结果。