电子书生化(8)

时间:2025-07-10

课后题答案

补的DNA片段。由于凝胶机械强度差,不适合于杂交过程中较高温度和较长时间的处理,Southern 提出一种方法,将电泳分离的DNA片段从凝胶转移到适当的膜(如硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,在进行杂交操作,称Southern印迹法,或Southern杂交技术。随后,Alwine等提出将电泳分离后的变性RNA吸印到适当的膜上再进行分子杂交的技术,被戏称为 Northern印迹法,或Northern杂交。分子杂交广泛用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系等。Southern杂交和Northern杂交还可用于研究基因变异,基因重排,DNA多态性分析和疾病诊断。杂交技术和PCR技术的结合,使检出含量极少的DNA成为可能。促进了杂交技术在分子生物学和医学领域的广泛应用。DNA芯片技术也是以核酸的分子杂交为基础的。
16.概述核酸序列测定的方法和应用领域。
解答:DNA的序列测定目前多采用Sanger提出的链终止法,和Gilbert提出的化学法。其中链终止法经不断改进,使用日益广泛。链终止法测序的技术基础主要有:① 用凝胶电泳分离DNA单链片段时,小片段移动,大片段移动慢,用适当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的DNA片段。② 用合适的聚合酶可以在试管内合成单链DNA模板的互补链。反应体系中除单链模板外,还应包括合适的引物,4种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的无机离子。如果在4个试管中分别进行合成反应,每个试管的反应体系能在一种核苷酸处随机中断链的合成,就可以得到4套分子大小不等的片段,如新合成的片段序列为-CCATCGTTGA-,在A处随机中断链的合成,可得到-CCA和-CCATCGTA两种片段,在G处中断合成可得到-CCATCG和-CCATCGTTG两种片段。在C和T处中断又可以得到相应的2套片段。用同位素或荧光物质标记这4套新合成的链,在凝胶中置于4个泳道中电泳,检测这4套片段的位置,即可直接读出核苷酸的序列。 在特定碱基处中断新链合成最有效的办法,是在上述4个试管中按一定比例分别加入一种相应的2¢,3¢-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),由于ddNTP的3¢位无-OH,不可能形成磷酸二酯键,故合成自然中断。如上述在A处中断的试管内,既有dATP,又有少量的ddATP,新合成的-CCA链中的A如果是ddAMP,则链的合成中断,如果是dAMP,则链仍可延伸。因此,链中有几个A,就能
得到几种大小不等的以A为末端的片段。如果用放射性同位素标记新合成的链,则4个试管中新合成的链在凝胶的4个泳道电泳后,经放射自显影可检测带子的位置,由带子的位置可以直接读出核苷酸的序列。采用T7测序酶时,一次可读出400多个核苷酸的序列。近年采用4种射波长不同的荧光物质分别标记4种不同的双

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