Western Blotting方法

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1. Western Blotting方法

直接法：

优点： 1.快速(一种抗体) 2.没有二抗交叉反应引起的非 特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便

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Western Blotting方法 间接法：优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高(多个二抗结 合位点) 3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker 缺点： 1.有交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化

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间接Western Blotting操作流程:SuperSignal® 底物与二抗HRP,AP反应,显色或发光

5SuperSignal®

3一抗与蛋白结合 (小鼠单抗 或兔多抗)

4HRP,AP标记二抗与一抗-蛋 白复合物结合

2

1电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上

漂洗和封闭

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2. 两种检测酶系统的比较HRP(辣根过氧化酶) AP(碱性磷酸酶)

大小最佳酶活性

40KdPH:5-7

140KdPH:8-10

酶活和二抗特异性 好于AP

抑制剂

氰化物， 硫化物 叠氮钠零度以下稳定 很多 快速 便宜

氰化物， 砷酸盐，有机磷， 二价阳离子螯合剂零度以下不稳定 部分 慢 昂贵

稳定性 底物 动力学特性 价格

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3. 检测方法 化学发光法: 灵敏、快速、高效、无害、特异性高 化学显色法: 方便、有毒、灵敏度较低、不易保存 同位素法 : 灵敏度高、不安全、 环境污染、不方便 和半衰期短 荧光底物法

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4. 影响Western blotting成功的要素

蛋白抽提/样品制备/电泳 膜的选择和转膜 封闭液的选择和封闭条件的优化 一抗和二抗的选择以及稀释倍数的优化 “通用”二抗 合适的底物：发光或显色底物 曝光时间的掌控 X- 光片,信号增强剂 Striping 抗体剥离buffer Eraser it底片背景去除剂

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蛋白抽提/样品制备/电泳 1.2. 3.

蛋白抽提M-PER®培养细胞总蛋白提取试剂 Pro#78501, 78503, 78505 T-PER®动物组织总蛋白提取试剂Pro#: 78510 B-PER®细菌总蛋白提取试剂Pro#: 78243, 78248,78260,78266 Y-PER®酵母总蛋白提取试剂Pro#:78990, 78991,78998 和78999 I-PER®昆虫细胞总蛋白提取试剂 Pro#:89802 P-PER®植物细胞总蛋白提取试剂 Pro#:89803 Mem-PER®真核膜蛋白提取Kit Pro#:89826 NE-PER®胞质 & 核蛋白抽提试剂 Pro#78833 线粒体抽提Kit Pro#:89874

4.5. 6. 7. 8. 9.

蛋白酶抑制剂 样品中是否有干扰物质 各种预制胶，转膜液，Markers

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膜的选择和转膜

膜：NC,PVDF 转膜成功？ QentixTM信号增强剂

MiserTM抗体节约缓冲液 (1/3-100)

胶上Western blotting

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转印膜比较

PIERCE:NC,PVDF

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封闭封闭液的选择1. 无生物素，无血清蛋白 2. 无交叉反应 3. 1-15分钟封闭时间 4. 10-20:1的信噪比

封闭条件的优化1. 时间 2. 温度

3. 去污剂

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如何选择封

闭液

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漂洗缓冲液

即开即用 用途广泛

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一抗和二抗的选择以及稀释倍数的优化一抗和二抗的选择： 一抗的特异性(单抗，多抗，片断)浓度 二抗：HRP活性(耦联效率)来源，浓度 通用”二抗：HRP标记蛋白A,G,A/G,L以及 SA-HRP 酶标二抗活性的保持(1) ethylene glycol,Pro#29810,-20°可保存2

年(2) SuperFreez HRP二抗稳定剂：1:1稀释 (Pro#:31503), -20°可保存1年 (3) Guardin HRP二抗稳定保存剂 (Pro#:37548, 37552),1:1000或1:100,000 倍稀释，4°可保存1年，室温6个月

稀释倍数的优化

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最佳抗体稀释倍数(点杂交) 2-5ul不同稀释梯度的样品于 NC膜，自然干燥10-30min 室温封闭1h 加入一抗/二抗：1/20,1/100; 5/20,5/100) X000 TBS或PBS洗膜4-6次 X5min(0.05% Tween-20)

加入二抗,室温孵育1h TBS或PBS洗膜4-6次X5min 底物孵育：8cm2/mL 曝光时间：30-60 Sec

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底物选择：

灵敏度 方便与否 经济与否

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Pierce Western Blotting底物一览

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SuperSignal ® Western 化学发光底物Twice the flash. Half the CashWestern Pico底物和Kit Western Dura增强底物和Kit Western Femto 超高灵敏型底物Kit Pierce ECL Lumi Phos碱性磷酸酶化学发光底物

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SuperSignal ® 化学发光底物发光的原理和特点 高灵敏度：比化学显色法 高103-106倍 快 速：1 min 高特异性：高信/噪比 检测方便： X光片或CCD 检测 多次曝光：选择满意的信 号强度 反复检测：用不同特异性 抗体，对同一蛋白上不同 决定簇进行检测分析

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1. SuperSignal® West Pico 化学发光底物 是用于Western bloting 的最经济 高效的选择

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SuperSignal® West Pico与ECLTM 发光强度和灵敏度比较 SuperSignal® West Pico 5分钟发光

ECLTM系统5分钟发 光

结果：相同条件下:一抗1ug/mL,二抗20ng/mL, SuperSignal® West Pico底物产生的光强度是ECL底物的2倍

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稳定性 常温下稳定保存至少1年，无须预 …… 此处隐藏：654字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……