植物表达载体构建

载体 vector克隆载体

载 体表达载体

原核表达载体 真核表达载体 植物表达载体

质粒图谱及质粒构建

启动子 外源基因 终止子

启动子 报告基因 终止子

(标记基因) 目的片段 选择标记

载体

表达载体(expressing vector)

特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序 列 大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位 点—克隆位点—转录终止信号

启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7 噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS):起始 密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列

在植物表达载体Ti质粒的结构： 侵染植物的土壤农杆菌中带有Ti质粒，侵染植 物后会产生冠瘿瘤。Ti质粒上有一段transferDNA,长为12-24kb,能转移并整合到植物基因 组中。

细胞分裂 素基因 冠瘿碱合 成基因 生长素基因 左边界

右边界(25bp)

冠瘿碱代谢基因 Vir gene

复制起始位点

Vir基因产物可诱导Ti质粒产生T-DNA 区域的单链线性拷贝，在其他如VIR D2,VIR D4, VIR B等蛋白的协助下，穿 越农杆菌及植物细胞的细胞壁、膜等， 最后整合到染色体中。

T-DNA的左右边界各有25bp的重复序 列，但右边界对T-DNA的整合更为重 要。有一些早期的植物转化载体并不 含有左边界。 T-DNA区域的大部分基因只有在TDNA插入到植物基因组后才表达，表 达产物与冠瘿瘤的形成有关。

Ti质粒作为转基因载体的缺陷： ---转化后会产生植物激素，阻碍转化细 胞的再生； ---冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不 大； ----Ti质粒长约200-800kb,过于庞大； ----Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。

双元载体不带有vir基因，但带有大肠杆菌及土 壤农杆菌的复制起始位点。所有基因 操作可以在大肠杆菌中完成，之后转 入一种经修饰后的Ti质粒农杆菌中， 该Ti质粒包含一整套vir,但缺失T-DNA 序列而无法转移，这样可提供仅vir基 因产物帮助双元载体转移。

共整合载体已很少用。外源基因首先克隆到一 个克隆载体上，该载体含有一段与 缺失T-DNA的Ti质粒有同源序列。 当该载体进入土壤农杆菌后，与Ti 质粒整合，然后由Ti质粒提供TDNA向植物细胞转移的vir基因产物。

病毒衍生载体比较小，易侵染植物并大量扩 增，可大量表达蛋白，但一般 难于整合到植物基因组中。