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核酸分子杂交技术

南昌大学第二附属医院：黄波

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核酸分子杂交技术的基本原理 按碱基互补配对原则，具有一定同源性 的两条核苷酸单链在适宜条件下形成双链 杂交过程具有高度特异性(即使有一个 碱基不配对都不能杂交)。 通过检测探针是否发生了杂交及杂交量 多少，从而对待测核苷酸序列进行定性和 定量分析。 核酸分子杂交的成败，关键在于探针。

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变性

复性

DNA-DNA 杂交双链分子

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(一)探针的概念、种类及其选择、探针的标记

1.探针的概念： 在化学及生物学意义上的探针(Probe),是指 能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子， 并可被特殊的方法所探知 核酸分子探针则是指带有标记物，能与互补核 酸序列退火杂交的特定已知核酸片段。 探针的设计和选择影响核酸杂交实验结果的高 度特异性、正确性。

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2.探针的种类、选择及特点 种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探

针、寡核苷酸探针选择：寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷

酸片段，并带有标记物特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可 以用于点突变检测；缺点是灵敏度低

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设计寡核苷酸探针遵循的原则：①探针长度：一般要求10~50bP。过短 则特异性降低，过长，则合成困难、杂交 时间延长，亦会出现非特异性杂交

② G:C碱基对含量应占40~60%;过 少，则不易杂交，或杂交双链不稳定；过 多，则会产生非特异性杂交③探针内部的互补碱基对不应大于4bP, 否则会形成探针内部的“发夹”结构。

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④同一碱基的连续出现次数不应超过4次 ⑤探针设计完后，最好利用基因库软件进 行分析，并与已知的各种基因序列进行同 源性比较，探针与非目的基因序列有70% 以上的同源性，或连续有8个以上的碱基 序列相同，则放弃。

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3.探针的标记物与标记一种理想的标记物应具备的特性：①高度灵敏性； ②标记物不影响探针的碱基配对特异性、 杂交特异性、杂交稳定性及Tm值； ③高度特异性(发生杂交能检测到，否 则检测不到);

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3.探针的标记物与标记④较高化学稳定性，保存时间较长； ⑤标记方法及检测方法简单； ⑥对人体无损伤，对环境无污染； ⑦价格低廉。

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放射性核素标记： 32P、35S、3H、125I、131I

优点是灵敏度极高 缺点是对人体有一定影响，对环境有污 染

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非放射性标记物：半抗原(生物素、地高辛);

配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明 等 化学发光物：标记物与某种底物反 应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸 酶可使发光底物发光

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(二)杂交 固相杂交 膜上印迹杂交

细胞原位杂交

液相杂交

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膜上印迹杂交的基本操作流程 用印迹技术将凝胶电泳分离的核酸片段转 移到特异的固相支持物上(转移后的核酸片 段将保持其原来的相对位置不变)。 再用标记的核酸探针与固相支持物上的核 酸片段进行杂交。 最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过 放射自显影等检测方法显示标记的探针的位 置及量的多少。

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1.印迹技术 印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素： 选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。

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⑴ 固相支持物的选择①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏； ②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少； ③结合后应不影响核酸分子与探针分子的杂 交反应； ④非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也 易被洗脱掉。

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目前常用的固相支持物 硝酸纤维素滤膜 尼龙膜 化学活化膜

滤纸

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硝酸纤维素滤膜 具有较强的吸附结合单链DNA和RNA的能力 特 别 是 在 高 盐 浓 度 ， 其 结 合 力 可 达 80μg/cm2~100μg/cm2。 这种结合主要靠疏水作用。

非特异性吸附核酸(探针)能力较弱，因此杂交信号本底值较低。

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缺点：①与核酸的结合力较弱 (因为是靠疏水作 用),在杂交及洗脱的进程中，核酸会慢慢 脱落，特别是在高温情况下，更容易脱落。 对于小分子量DNA片段结合力更弱，因此不 太适合小分子DNA片段的杂交。 ②硝酸纤维素膜质地较脆，特别是经烘烤后 更易破损，因此操作不方便，须特别小心。 硝酸纤维素膜与核酸的结合，有赖于高盐浓 度，而高盐溶液又不适合于电转印迹法

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尼龙膜 未经特殊处理的尼龙膜，叫普通尼龙膜。经 过了正电荷基团修饰的，又叫特殊尼龙膜。 特殊尼龙膜带有正电荷，对核酸的结合力要 比硝酸纤维素膜强好多倍。 经短波紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱 基可与膜上的带正电荷的氨基相互交联。因此 特别适用于小分子核酸片段的杂交。 碱处理也可使核酸牢固地结合在尼龙膜上， 特别适用于菌落原位印迹法。

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尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。

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⑵ 印迹方法①虹吸印迹法②电转印迹法 ③真空转移法Southern印迹法 Northern印迹法