标记免疫技术

时间：2025-04-22

标记免疫技术

邹全明第三军医大学医学检验系临床微生物学和免疫学教研室

标记免疫技术= 免疫技术+标记技术抗原抗体反应特异性标记免疫技术的主要特点：示踪物标记灵敏性

高特异性、高灵敏性

标记免疫技术

免疫组化技术示踪物及标记技术

免疫测定技术

酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术化学发光技术金免疫技术生物素-亲和素免疫放大技术 ……

第一节酶免疫技术基本原理利用酶催化底物反应的生物放大作用, 提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。

基本特点：①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 ②酶促反应专一性，保证特异性。 ③底物反应放大作用，提高敏感性。 ④酶标试剂保存稳定。 ⑤操作简便，安全易行。

一、酶免疫技术的分类酶免疫组化酶免疫技术酶免疫测定异相酶免疫测定用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体

均相酶免疫测定固相酶免疫测定(ELISA)

液相酶免疫测定

二、酶免疫技术的技术要点 (一)固相载体基本要求结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。

种类与选择 1.塑料制品 2.微颗粒 3.膜载体

(二)酶与酶作用底物1. 用于标记酶的要求：酶活性高标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性酶催化底物后信号易判定或测定酶活性不受样品中其他成分的影响酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉

2. 常用酶及其底物 (1)辣根过氧化物酶(HRP) 常用底物：邻苯二胺(OPD):反应显橙黄色，应避光，致癌性。四甲基联苯胺(TMB):反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。

(2) 碱性磷酸酶(AP)常用底物为对硝基苯磷酸酯(p-NPP), 产物为黄色。 *AP灵敏性高与HRP,但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP,且价高，故应用不如HRP普及。

(三)酶标记抗体或抗原基本要求：酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体的特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化。

酶标记方法

1.交联法以双功能交联剂为“桥”,分别与酶和抗体(抗原)连接形成结合物。如戊二醛交联法。

2.直接法用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体(抗原)结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶(如HRP)标记物制备。

(四)标记抗体鉴定 (五)免疫吸附剂 (六)试剂最佳工作浓度的选择

三、酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosorbent assay, ELI

SA)

(一)基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性(固相抗原/抗体的形成) 持其免疫活性(固相抗原/抗体的形成) 在测定时，把受检标本( 在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应(抗原抗体反应) 体表面的抗原或抗体起反应(抗原抗体反应)

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。酶标抗原抗体复合物的分离) (酶标抗原抗体复合物的分离) 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。显色反应) (显色反应)

(二)ELISA技术类型：ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。酶作用的底物。

酶联试剂

阳性对照

酶标记物

显色液 A

终止液

反应板

显色液 B

浓缩洗涤液

加样枪与吸头

阴性对照

1.双抗体夹心法