异育银鲫非O1_非O139群霍乱弧菌的分离及鉴定(2)

第2期秦蕾，等.异育银鲫非O1/非O139群霍乱弧菌的分离及鉴定131

积死亡率高达45%。目前关于霍乱弧菌(V.cholerae)感染异育银鲫的报道还尚未见到。本实验首次对该病的病原进行了较为详细地研究，为异育银鲫霍乱弧菌病的防治提供实验依据。

乱弧菌多价诊断血清，取少量培养的菌株与血清混匀，然后轻轻摇动玻片。于1min内呈明显凝集者判定为阳性；呈均匀浑浊者为阴性。同时设生理盐水作对照。1.6

药物敏感性测定

采用K-B琼脂法[7]对菌株

SX-1进行药物敏感性测定，试验重复3次，结果判定根据药敏纸片的抑菌范围解释标准进行。

1

1.1

材料和方法

主要试剂

TSB培养基、细菌微量生化鉴定管

购自北京陆桥技术有限责任公司；引物、dNTP和

2

2.1

结果

水浸片观察可见，在所

TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术服务有

限公司；脱纤维羊血购自杭州新锐生物工程有限公司；O1群和O139霍乱弧菌多价诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。1.2

病鱼检查及病原的分离

自江苏射阳一家发病

的异育银鲫养殖场随机采取7条症状明显的病鱼，取其鳃、体表病灶和内脏等器官组织进行水浸片检查。另取4条病鱼做病原分离，鱼体消毒后无菌解剖，从体表病灶和肝脏等组织取样划线接种TSB平板，28℃培养24h，从优势菌落中选取单个菌落，再次平板划线获得纯培养菌株。同时将分离菌株接种TCBS和血琼脂平板进行培养观察。1.3

动物回归试验

试验用健康异育银鲫平均体长

19cm，20尾为一组，每组设一平行，水温28±1℃，循环水饲养，试验前暂养1周。将分离株用麦氏比浊仪制成9×108cfu/mL的新鲜菌悬液。将鱼麻醉(MS-222)后每尾腹腔接种0.3mL的菌液。对照组同时注射同体积无菌生理盐水。试验期间每天早晚各投饵一次，共进行14d。对刚死亡的病鱼立即进行细菌分离。1.4

病原菌的鉴定

0.5%的磷钨酸负染做透射电

镜形态观察。采用手工与细菌微量生化鉴定管鉴定相结合的方式对菌株进行生理生化鉴定，每项测试重复两次。为进一步明确菌株的分类地位，对其进行16SrDNA序列分析。用细菌通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')进行16SrDNA序列的扩增。扩增产物由Invitrogen公司测序。测序结果比对分析，根据比对结果选取相关菌株的序列，用Mega4软件构建系统发育树，Bootstrap1000次循环检验发育树各分支的置信度。1.5

血清型鉴定

在玻片上加1滴O1群、O139霍

病鱼检查及病原分离

有被检病鱼体内均存在有大量运动活泼的细菌，其形状呈弧形；同时在一条病鱼的鳃中发现有少量粘孢子虫寄生。病原分离共得到5株优势细菌(命名为SX)，经TSB培养呈现出相同的菌落形态：圆形、隆起、半透明、边缘整齐和光滑。将5株菌分别接种到TCBS培养，都能形成黄色菌落；经血琼脂培养均发生β溶血。2.2

动物回归试验

将SX分离株人工感染鱼5d

内实验组的鱼死亡率即达100%。感染发病的鱼表现出与自然发病时相似的临床症状，而且从感染发病死亡的鱼体内均可以重新分离到优势单一的菌株SX。在试验进行的14d内，对照组鱼无发病和死亡。2.3

病原菌株的形态和生理生化特性

5株菌具有

一致的表型特性：革兰氏阴性，弧形，端生单鞭毛，无荚膜和芽孢，大小为1.3μm～0.9μm×0.2μm～0.4μm(图1)；运动活泼；氧化酶和接触酶试验阳性；能液化明胶；发酵葡萄糖产酸不产气；发酵半乳糖；不发酵棉籽糖，阿拉伯糖，乳糖，甘露糖，果糖，蔗糖，山梨醇，肌醇，侧金盏花醇，七叶苷和水杨苷；甲基红试验阳性，V-P试验阴性；不产H2S；产吲哚；精氨酸双水解酶和脲酶试验阴性，赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶和DNA酶试验阳性；对O/129敏感；霍乱红试验阳性(表1)。通过形态和生理生化特征鉴定，5株分离菌应为同一种细菌。参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏鉴定细菌学手册》和《鱼类和其他水生生物实用细菌鉴定手册》，发现该菌株与霍乱弧菌(V.cholerae)表型特性相符。2.4

病原菌株的16SrDNA序列分析

菌株SX的

16SrDNA序列扩增长度为1423bp(JN555611)。在GenBank中进行Blast显示该菌株与霍乱弧菌(V.cho-

lerae)相似性较高；经EzTaxonServer2.1进一步比