矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

DOI:10.13989/http://www.77cn.com.cnki.0517-6611.2014.17.007

JournalofAnhuiAgri．Sci．2014，42（17）：5380－5384安徽农业科学，责任编辑石金友责任校对况玲玲

矮牵牛PhDFＲ基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草

的遗传转化研究

1，21，33431*4

曾闻，肖向文，刘海峰，王俊铎，罗城，李晓波，郑巨云科学院经济作物研究所，乌鲁木齐830091）

（1．中国科学院新疆理化技术研究所，干旱区

植物资源化学重点实验室，乌鲁木齐830011；2．中国科学院大学，北京100049；3．中国彩棉（集团）股份有限公司，乌鲁木齐830016；4．新疆农业

并对烟草进行遗传转化。［方法］从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFＲ基摘要［目的］构建矮牵牛PhDFＲ基因的植物表达载体，因，通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段，将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。［结果］构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPTII和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFＲ-GFP和pCAMBIA3301-PhDFＲ-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证

了所构建表达载体的正确性和实用性。［结论］所构建的表达载体为进一步研究PhDFＲ基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础，为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达载体。关键词DFＲ基因；植物表达载体；烟草遗传转化；Bar中图分类号S188文献标识码A文章编号0517－6611（2014）17－05380－05ConstructionofPlantExpressionVectorCarryingPetuniaPhDFＲGenesandHerbicideＲesistanceBarGeneandItsTransformationintoTobaccoZENGWen，LIXiao-boetal（KeyLaboratoryofChemistryofPlantＲesourcesinAridＲegions，XinjiangTechnicalInstituteofPhysicsandChemistry，ChineseAcademyofSciences，Urumqi，Xinjiang830011；UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049）Abstract［Objective］TheaimwastoconstructaplantexpressionvectorcarryingPetuniasPhDFＲgeneandtogeneticallytransformitintoto-bacco．［Method］TwoPhDFＲgenewasclonedfromPetuniavarietieswithdifferentflowercolorinthepreviousstudy．Throughmultitechnicalmethodsincludingsequencecloningoftargetgenes，doubleenzymedigestion，plasmidvectorconnectionandtransformation，targetgenePhDFＲwereintroducedintotheplantexpressionvectorpCAMBIA2300andpCAMBIA3301．ThesevectorsweregeneticallytransformintoAgrobacteriumtumefactionsstrainGV3101andthenappliedingenetictransformationoftobaccorecipientplants．［Ｒesult］Theplantover-expressionvectorscarryingtargetgenesPhDFＲ，includingpCAMBIA2300-PhDFＲ-GFPwhichcontainedkanamycinresistanceselectionmarkergeneNPTIIand

GFP-fusedgene，andpCAMBIA3301-PhDFＲ-GFPwhichcontainedBastaresistancemarkergeneBarandGFP-fusedgene，weresuccessfullycon-structed．ThecorrectnessandpracticabilityofexpressionvectorconstructwerefurtherverifiedbyGUSstaininganalysisoftransgenicplantsfur-ther．［Conclusion］Theconstructedplantover-expressionvectorsprovideafoundationforfurtherstudyonthefunctionofPhDFＲgenesinregula-tingplantflowercolorandgeneticengineeringrelatedtomodificationofplantflowercolor．Thisstudyalsoprovidedexcellentalternativeplantex-pressionvectorsforplantgeneticengineeringwork．

KeywordsDFＲgene；Plantexpressionvector；Tobaccogenetictransformation；Bar

类胡萝自然界中的花色素主要有3大类群：类黄酮类、卜素类和生物碱类罗兰色和蓝色

［2］

［1］

应，最终形成了稳定的花色素苷，各种不同的花色素苷的比例最终决定了植物的外观颜色。

在花色素苷合成途径中，从第2到第3阶段的转变中，由第2阶段产生的黄烷酮和二氢堪非醇，可以在不同的酶作用下，或者进入花青素合成途径，或者合成其他类黄酮物质，此过程中二氢黄酮醇还原酶（DFＲ）在花色素苷合成途径中起着关键的作用，由DFＲ作用得到的产物，将作为后续合成花色素苷的底物，从而最终形成各种稳定的花色素苷。DFＲ的氨基酸序列决定了其底物的种类，不同物种中DFＲ与底物的结合区域是高度保守的，其中第134位氨基酸残基直接决定底物的特异性

［7］

，而类黄酮类色素中的花色素苷（antho-

cyanin）是影响花色的主要色素，控制着花的粉红色、红色、紫

。植物花青素合成途径已经为人们所熟悉，

［3－6］

类黄酮生物合成途径中花色素苷形成如图1所示。

花青素合成大致可以分为3个阶段

，第1阶段由苯

丙氨酸到4－香豆酰CoA，这是苯丙烷类次生代谢途径所共有的；第2阶段是类黄酮代谢的关键反应，由4－香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢堪非醇，该阶段产生的黄烷酮和二氢堪非醇在不同酶作用下，可转化为花青素和其他类黄酮物质；第3阶段由二氢黄酮醇到各种花青素的合成，其中有关的酶5'-如类黄酮3'-羟化酶、类黄酮3'，羟化酶、二氢黄酮醇还原酶，花青素合成酶ANS和类黄酮3-葡糖基转移酶3GT，在这个过程中，花色素经过各种甲基化、糖基化、羟基化等等反

高品质彩色棉花种质资源创制（2013AB003）；中国博士后科

学基金项目（2012M521827）；兵团博士资金项目（2013BB005）；转基因彩色棉花新品种选育（2013ZX08005-005）。

作者简介曾闻（1987－），男，新疆阜康人，硕士研究生，研究方向：植

物基因工程。*通讯作者，副研究员，博士，从事植物分子

。生物学研究05-20收稿日期2014-基金项目

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