野桑蚕_家蚕海藻糖酶基因5_侧翼区的克隆与序列分析_赵巧玲

年

月

中

国

蚕

业

揖难夔你噜孵氰暴曝德酬瓤毗岭缈瓷赵巧玲

唐顺明

张志芳

何家禄

农业部家蚕生物技术重点开放实验室

中国农业科学院蚕业研究所A C G I lC A C T一3,,

海藻糖是一种双糖、

,

广泛存在于包括细菌酵,

、

’

,

母植物和无脊椎动物在内的生物体内主要功能是储备生物代谢所需的能源,。

1. 3

野桑蚕家蚕基因组 D N A的提取1 09.

、

取蚕幼虫后2 0 0 0 2 6 ( l ): 6 3、

在昆虫血液中海藻

,

部丝腺约组D N AL4。

,

参照文献 (蚕业科学

,

,

-

糖是一种最重要的糖类具有供给能量和提供合成生物大分子的底物等功能r h糖酶 ( T e a。

4 )快速制备基因组 D N A方法提取野桑蚕家蚕基因 6

其功能主要是通过海藻。

a e l s )的作用来实现的,

家蚕海藻糖酶有可

P C

R

法克隆野桑蚕尸、·

、

家蚕苏菊x明虎的海藻

·

·

溶型和膜固定型两种类型可溶型主要存在于蛹期中肠织。,

糖酶基因 5侧冀区片段及其纯化后的野桑蚕家蚕苏菊94℃Zm inx·

分别以经碱变性,

而膜固定型存在于包括卵巢在内的多种组。

明虎基因组 D N A为模板15 5 5 3℃,

这两种类型酶是由同一个基因表达而形成不同海藻糖酶膜固定型存在于向血液,

预变性,

Zm in

,

94℃,

l m in。

4 55 72℃

,

的成熟海藻糖酶,

3 0 5 3 5个循环

7 2℃

延伸 7 m in,

P C R产物经凝、

面的卵巢膜内该基因的表达是由滞育激素诱导调

s胶电泳分离目的大小片段用 g l aLS

s

m

k法纯化回收 l i

。

控

。

卵母细胞通过位于膜内的海藻糖酶将血液中,

野桑蚕

、

x家蚕苏菊明虎的海藻糖酶基因 5

·

·

’

海藻糖降解成葡萄糖然后吸收到胞内最后合成

,

侧翼区片段的亚克隆与测序PC R

将 pG EM 3 Z和回收的

糖原从而导致蚕卵的滞育、·

,

。

从而海藻糖酶基因是。

产物分别用c E,

o

R I

/B.

n l a。。

H I

双酶切后。

,

经

从分子水平来解明家蚕滞育机理的一个重要途径本实验从野桑蚕家蚕苏菊,

4 T

D N A连接酶连接Z一B ma n d

转化于 E、

1 TG I

筛选出重组M in g huu

x

明虎基因组中分别’

·

质粒 p 3A la bHa rboo

e T r滋.

pS

K一Ba

m

T r eo.

j (S uNew Y

u x

)具

,

克隆了野桑蚕和家蚕的海藻糖酶基因的 5侧翼区片段并进行了测序分析以供进一步的启

动子功能研

体克隆方法参照文献 ( S

m broe.

e e k J Mo一

la r

。

zo n i

叮

呱r

。

理 mara

n;`

Zn ds s。,

d。

o r

k: C o ld S p r i n g

究现报道如下1 L l

,

。

La bo

to r y

pre

1989)

经酶切鉴定正确的重e Pt o c r

材料与方法试验材料与试剂;

组质粒 D N A用于测序

由大连宝生物技术有限公司、

野桑蚕采集于中国农业科,

测定序列

。

a ls n用 D N A STA R B LA ST和 M t。

软件

学院蚕业研究所桑园内

家蚕品种为苏菊+ ) ( A、

·

x,

明

·

进行序列分析2

虎

z克隆所用的质粒载体为 p G E M 3 (.

m p与

宿主

结果与分析

菌为 E

。

1 1T G I 0

,

均由农业部家蚕生物技术重点开放o

.2 1

野桑蚕

、

x家蚕苏菊明虎的海藻糖酶基因夕

·

·

实验室保存;主要试剂 c Ey t Ta q酶、

R I

、

B

m a

H I

H ig h if d e l i -

侧冀区片段的扩增

P C R产物经 1%.

琼脂糖凝胶电,

4 T。

DNA

G bc o连接酶及其他主要试剂购自 ix根据已报道家蚕朝日东海··

泳鉴定 (图略 )获得约 l片段.2 2。

,

s kb,

D N A片段

u与 S ( 19 9 7 )报

B R L公司 L Z

道的相应片段大小一致表明已经获得目的大小的经相应的限制性内切酶酶切,

引物的合成

亚克隆到’

的海藻糖酶基因序列D 8 6 2 12

(G e

n

Ba

n

k Ao

e e e s s、

io

n

NO

p G EM

Z质粒进行测序 3·

,

。

)设计一对引物:`

,

e分别导人E。

R I B

二

H l限

野桑蚕和家蚕苏菊 x明虎的海藻糖酶基因 5·

·

制性内切酶的酶切位点成Re。

由上海生物工程公司合

侧翼区片段的测序结果与序列分析

野桑蚕和家:

r d s F, a o

5

一

G A旦奥鑫T,

巡

T TC C A

竹

GCC

蚕苏菊一

x

明虎的海藻糖酶基因 5侧翼区片段经通6

·

`

C C A A G T T A G G C一 3v e r s e:

`

P用引物s

和 T 7测序后

,

再合成一条测序引物A CG T A一3’,

5

`

5

`

一

A A G G A T C CG TG A A G A C G A T C A

G CT CT G A A T A CG CA C

测得完整

9

中

闻

番

业

卷

期

蕊几

C

CCA

了口C C C C几蕊

A…… 此处隐藏：5963字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……