总RNA的提

Taq 酶（2U/μl） 1 μl

（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心。

（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G-3-PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。

（4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

（5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。

注意事项：

1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G-3-PD（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

5． 防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶处理RNA样品。

（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，消除基因和mRNA的共线性。

附注：

（1） -actin 引物序列：

sense 5-ACCATGGATGATGATATCGCC-3

antisense 5-GTGCCAGATTTTCTCCATGTC-3

片段长度 264（71-334）

（2）目的基因GAPDH引物序列

sense 5' ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG 3'

antisense 5' CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG 3'

片段长度：480（103-582）