·２２４２·，，，国际检验医学杂志年月第卷第期·检验仪器与试剂评价·

时间分辨荧光免疫法乙型肝炎病毒ｅ抗原定量

测定试剂盒的研制与性能评价＊

谭玉华１△，曾　华２﹟，魏绍静３﹟，董　梅４﹟，陈建起１，袁国悦１，李水珍１，王佳佳１，吴道贫１

（广州市丰华生物工程有限公司，广州５中山大学孙逸仙纪念医院检验科，广州５１．０１７３０；２．１０１２０；

）广州市第八人民医院检验科，广州５中国人民解放军第三〇九医院检验科，北京１３．１００６０；４．０００９１

）目的　对自研时间分辨荧光免疫法（乙型肝炎病毒ｅ抗原（定量测定试剂盒进行性能评价。方法　ＴＲＦＩＡ）ＨＢｅＡ　　摘　要：ｇ

，固相双抗体夹心二步分析法检测人血清ＨＢ并对自研试剂盒线性范围、精密２株单克隆抗体分别用于固相包被和铕标记，ｅＡｇ度、分析灵敏度、特异度等进行评价，与对照试剂盒平行检测１检验结果采用线性回归分析，一致性采用Ｋ０２０例样本，ａａ检验。　ｐｐ／结果　自研试剂盒线性范围为０．相关系数达０．批内和批间变异系数均小于１灵敏度达６０～１６０ＮＣＵｍＬ，９９，０％，

／检测国家标准物质或自制参考品的效价比为０．检测国家参考品符合国家的质量检定标准，０．０５ＮＣＵｍＬ，９０～１．１０，３７℃恒温箱烘烤６ｄ后检测性能无明显改变，与同类试剂检测结果线性相关系数达０．临床研究试验总符合率达１９５，００％，Ｋａａ指数为ｐｐ灵敏度高、准确性好、线性范围宽、符合率高，可取代对照试剂盒，值得推广应用。１。结论　自研试剂盒精密度好、关键词：时间分辨荧光免疫法；诊断　乙型肝炎病毒ｅ抗原；　试剂盒，

：／ＤＯＩ１０．３９６９４１３０．２０１２．１８．０３４．ｉｓｓｎ．１６７３－ｊ

文献标识码：Ａ

（）文章编号：１６７３４１３０２０１２１８２２４２０３－－－

感染是发病率极高的传染性疾病，ＨＢＶ）　　乙型肝炎病毒（且每年约有１肝硬化和原００万人死于ＨＢＶ感染所致肝衰竭、

１］

。ＨＢ检测是ＨＢ发性肝细胞癌［Ｖ血清标志物（ＨＢＶ－Ｍ）Ｖ

感染辅助诊断的重要依据，特别是ＨＢ乙型肝炎表面ＶＤＮＡ、　

／１００ＵｍＬ　ＨＢｅＡａｕｌｈｒｌｉｃｈ研究所提供；－Ｅｇ校准物质为德国ＰＨＢｅＡａｎｅｌ国家参考品由中国药品生物制品检定ｇ检测血清ｐ

免疫荧光法）购于苏州新波研究院提供；ＨＢｅＡｇ检测试剂盒（生物技术有限公司；ＶｉｃｔｏｒＴＭ２Ｄ１４２０型ＴＲＦＩＡ仪购于美国

ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司。　／Ｈ７．８Ｔｒｉｓ１．３　固相反应板的制备　用５０ｍｍｏｌＬ、ｌ缓－ＨＣｐ冲液将ＭＣ每孔加入１ｅａｂ１＃稀释至最佳包被浓度，００μＬ，－／洗涤１次，再每孔中加入含有１４℃孵育过夜，０ｇＬＢＳＡ的上　述缓冲液２甩干后晾干，真空封膜，５０μＬ，３７℃孵育２ｈ，４℃保存。

１．４　铕标记物的制备　将１ｍＭＣｅａｂ２＃加入带有滤膜的－ｇ　

／，离心管中，再用标记缓冲液重复１００００ｒｍｉｎ离心９～１０ｍｉｎ　洗涤３～５次；将２００μＬ　ＭＣｅａｂ２＃和０．３ｍ－ｇ铕标记试剂充

／分混匀，反应液经用５Ｈ７．８０４℃振荡（２２±２）ｈ；０ｍｍｏｌＬ、ｐ层Ｔｒｉｓｌ缓冲液平衡的ＳｅｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ柱（１ｃｍ×４０ｃｍ）－ＨＣ　－ｐ

析，Ａ２８０监测收集第一洗脱峰。１．５　试剂盒校准品的制备　将收集的ＨＢｅＡｇ阳性血清按《》中国生物制品规程（的要求进行处理。以ＨＢ２０００版）ｅＡｇ血清液体标准物质［为参照，ＧＢＷ（Ｅ）０９００９９］ＨＢｅＡｇ阳性血／／清或ＨＢｅＡ０ＬＢＳＡ的５０ｍｍｏｌＬ、　ｇ基因重组抗原用含５ｇＨ７．８Ｔｒｉｓｌ稀释液定量稀释成０、０．６、２．５、１０、４０、１６０卫－ＨＣｐ

／。以德国Ｐ生部临床检验中心单位（ＮＣＵｍＬ）ａｕｌｈｒｌｉｃｈ研－Ｅ

／究所提供的ＨＢｅＡ１．２ＮＣＵｍＬ约等于ｇ校准物质为对照，／／。１．０ＰａｕｌｈｄｉｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅＵｎｉｔｍＬ（ＰＥＩＵｍＬ）－Ｅ　　　

１．６　方法学的建立　采用固相双抗体夹心ＴＲＦＩＡ。在固相

抗体微孔反应板中依次加入１室温振荡００μＬ校准品或样本，，洗板４次拍干，加入１室温振６０ｍｉｎ００μＬ铕标记物工作液，

，荡６洗板６次拍干，加入１室温振荡５０ｍｉｎ００μＬ增强液，，将反应板放入泰莱Ｔ并用随机ｍｉｎＲＦＩＡ仪内进行荧光计数，配备的分析软件进行数据分析。

））抗原（和乙型肝炎ｅ抗原（检测为临床抗病毒ＨＢｓＡＨＢｅＡｇｇ

２］

。ＨＢ治疗提供了有效依据［ｅＡｇ检测是预测抗病毒疗效的有

效指标，可间接反映机体免疫状态和对抗病毒治疗的应答情

］１７－。美国、况［欧洲以及亚太地区慢性乙型肝炎指南或者共识

都将ＨＢｅＡｅＡｇ血清学转换作为ＨＢｇ阳性患者抗病毒治疗的

治疗终点。明确ＨＢ逐步实现ＨＢｅＡｅＡｇ定量检测的意义，ｇ

２］

。ＨＢ定量检测的标准化和临床推广极为重要［ｅＡｇ定量测定

试剂的研发和商品化是进一步临床研究的先决条件

［７］

。卫生

部临床检验中心于２为中００８年研制了ＨＢｅＡｇ血清标准物质，国ＨＢ以ＨＢｅＡｅＡｇ检测规范化和标准化奠定了基础。因此，ｇ

血清标准物质为试剂量值溯源，笔者利用时间分辨荧光免疫法（研制了ＨＢ并对试剂盒性能进ＴＲＦＩＡ）ｅＡｇ定量测定试剂盒，行了评价，现报告如下。１　资料与方法

［８］

体外诊断试剂临床研究技术指导原则》１．１　一般资料　按《的要求，在中山大学孙逸仙纪念医院、广州市第八人民医院、中国人民解放军第三○九医院采集临床标本共１０２０例。　针对不同位点的１．２　试剂与仪器　ＨＢｅＡｇ基因重组抗原、

抗－ＨＢ购于北京中检ｅ单克隆抗体（ＭＣｅａｂ１＃和ＭＣｅａｂ２＃）－－维康技术有限公司；牛血清清蛋白（购于美国ＳＢＳＡ）ｉｍａ公ｇ司；ＳｅｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ购于瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；９６孔微孔板购　－ｐ

３＋

）于深圳市金灿华实业有限公司。铕（标记试剂盒由ＷＥｕａｌ－

增强液、洗涤液、实验缓冲液和样本稀释液均为ｌａｃ公司提供；

、自制；泰莱Ｔ恒温振荡ＨＢｅＡＴＲＦＩＡ）ＲＦＩＡ仪、ｇ诊断试剂盒（仪、全自动洗板机由广州市丰华生物工程有限公司提供；ＨＢｅＡｇ血清液体标准物质由卫生部临床检验中心提供；

＊

基金项目：广州经济技术开发区、广州高新技术产业开发区、广州出口加工区、广州保税区科技项目（重点科技攻关计划资助项目２０１０Ｑ－

﹟）。　△　通讯作者，：。Ｐ１７４Ｅ－ｍａｉｌｔａｎｗｈａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ＠ｙ　同为第二作者。ｙｙ