肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

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温浙盛，等P肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

表达的$%&’#!和$%&’()%*%+,$%&’#!和$%&’()%*%+,。

分别与正常人体细胞膜模型-./0.10/2(34!56!6!7-./0.80和设计的肿瘤细胞膜模型-.80.94:6;7，

-./0.80.90/2(3，.9，!56!6!7，!56!6!6!7接触4检测核糖体表达法筛选穿孔多肽的可行性和优化人工合成的肿瘤脂质体细胞膜模型。!"#

体外多肽筛选

先后分组建的肽库经体外翻译成.<$复合体，别与生物素标记的=+’>?@3%A和正常人体细胞膜模

型接触4经预筛选步骤去掉筛选前因BC=库组建的过程中发生移码突变含终止码和能与正常人体细胞膜模型结合的那部分肽链4保留预筛选后的.<$复合体与优化的肿瘤膜模型结合4利用蛋白质洗提技术提取牢固结合伸入膜内层的.<$复合体。利用逆转录-<D?./<7技术将E<C=转录扩增成BC=4再进行第二个循环筛选4如此数个循环筛选出特异结

（图#）合的.<$。

含卡那霉素平板上4!#M!"2后挑选单克隆并进行测序4分析BC=序列。!")

合成肽链检测筛选多肽体外抗肿瘤效果分析BC=序列编码多肽4选择合成出现频率高4具有能形成!?螺旋结构的多肽。选择非小细胞

肺癌细胞株-C/N?KO"57和正常人体成纤维（//B?（日本筑波大学医学院赠送）细胞株体外培养#;9G）

贴壁后，加入合成肽-浓度介于!PLM!55"E(30Q7培养OR2，加入$DD溶液继续培养O2，再加入酸化异丙醇，充分振荡后过夜，测L;5+E处的吸光度-!7值4按公式计算细胞增殖抑制率S细胞增殖抑制率T-对照组!值U用药组!值70对照组!值V!55WX。检测合成多肽体外对C/N?KO"5与//B?#;9G细胞株的抑制作用4同时选择长春瑞滨-H>+(*I3Y>+I，CHZ7作阳性对照。

*

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结果

核糖体表达法筛选穿孔多肽的琼脂糖凝胶电我们设计的正常人体细胞膜模型-./0.10

泳结果

/2(34!56!6!7和肿瘤细胞膜模型-.80.94:6;74经核糖体表达法能成功地筛选到相对应的穿孔多肽4排除阳性结果是来自E<C=的非特异性结合和BC=模板消化不完全。应用细胞膜模型./0.80.90/2(3-!56!6!6!7和./0.80.9-!56!6!7筛选$%&’#!4只得到非常微弱的电泳条带4而用来筛选

（图:）。说明$%&’()%*%+,却可以得到非常强的条带

图#

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体外多肽筛选

细胞膜模型./0.80.90/2(3-!56!6!6!7和./0

.80.9-!56!6!7并不能很好地反映肿瘤细胞膜磷脂特性4不能作为肿瘤细胞膜模型筛选出可以在肿瘤细胞膜上穿孔的多肽。

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&I3IJ’>(+P

*"*多肽筛选结果

"个循环筛选后得到的高度特异结合的.<$

复合体，经逆转录技术扩增成BC=，克隆扩增BC=，挑选单克隆进行测序4以期了解特异结合多肽的特性，从中找出共同点-表!7。*"+

合成多肽体外抗肿瘤效果

三组序列中各选择一列有代表性的有!?螺旋形成倾向的氨基酸序列-9I[=:4$G\B]81H<B$@<</Q]N9Q<9]/HK^9I[Z:4$G\B]</Q=1K=NG1]=Q<9KQ=H\B和9I[/!"4$G\B]<\]@1<]</@\1.@H99\@Q\7在体外固相合成4$DD法检测体外抗非小细胞肺癌C/N?KO"5效果及对正常人体成

（表#）纤维细胞//B?#;9G的影响。

!"$克隆扩增的%&’(测定编码多肽的%&’序列

应用DF.FD=/3(+>+AG>’将数个循环筛选后

扩增的BC=产物直接与载体-HIJ’(*7连接4热休克法转染感受态细菌-BKL%74将转染感受态细菌铺在

万方数据