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第五节 放射配体受体结合实验方法与技术

一、基本概念

1、受体（ receptor） 一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。

2、配体（ligand） 能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。

3、判断受体的标准 真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。

4、受体的基本分类 化学门控离子通道受体； G蛋白耦联受体。

5、受体调节的方式

1）共价调节（covalent modification） 尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。以乙酰胆碱受体为例，细胞内cAMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加8～10倍。

2）非共价调节（non-covalent modification）影响受体功能的非共价调节机制包括①膜电位的变化；②机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；③受体和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷酸）之间的变构影响；④膜脂质环境的改变等。

3）协同性调节（coordinate regulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。

4）链锁反应（receptor cascades） 另外一种可能的调控机制，即一个受体被激活之后，可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。称之为放大性的链锁反应。

二、放射配体结合法的应用领域

1、阐明药物作用机制；2、新药设计和药物筛选；3、探讨疾病的病因、发病机理，提高临床合理用药和诊断水平；4、测定组织或血液中药物浓度；5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。

三、放射受体结合实验技术简介

1、放射配体的选择 需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。拮抗剂性配体必须能阻断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。放射性受体结合试验中，最常用的放射性同位素是氚，[3H]配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性，使用较安全，其信号必须用闪烁技术加以放大。放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率，理想的配体应有不少于99%的特异性结合。

2、组织的选择和制备 用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体。用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等。

3、缓冲液 最常用的缓冲液是50mmol/L，PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液；重碳酸盐、磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。

4、非特异性结合的测定 非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活性的并可使受体饱和的非放射性配体。特异性结合量是指配体与靶受体结合量，可由总结合量中减去非特异性结合量求出。

5、孵育条件 结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。需要经过大量的实验才可摸索出最佳的测定条件。

6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离

最常用的最有效的分离方法是过滤，结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。通常用2～5ml冷缓冲液冲洗2～3次就足够了。过滤完成后，滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液闪测定。当放射配体解离较快时，可用离心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分离出来。其它方法还有：凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。