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碱洗脱法 收集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。

（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响

DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶，分成拓扑异构酶I和II，抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一种质粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺旋带保留。此方法亦可改进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。

（六）药物对细胞核酸代谢的影响 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标记前体物如3H-TdR，3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去， 用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。

（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等的块状，并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180～200碱基对)的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状，凋亡小体形成。检查细胞凋亡的方法有：

1、荧光显微镜的形态学检查 该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理，建立DNA的荧光探针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。

2、流式细胞光度术 该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA， 因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。

3、琼脂糖电泳分析法 利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。

第八节 心脑血管药理学实验方法与技术简介

心脑血管药物实验方法很多，择其要者简介如下：

一、血压测定及相关模型

血压测定法大体分为直接和间接测压法。直接测压可选用颈动脉或股动脉插管，通过压力换能器记录血压变化，一般用麻醉动物作急性实验。常用的间接测压法主要有大鼠尾容积测压及尾动脉脉搏测压法。实验性高血压模型有：1、肾血管性高血压模型（肾动脉狭窄性高血压模型），分为2肾1夹型（两侧肾完整，一侧肾动脉狭窄）、1肾1夹型（一侧肾切除，另一侧肾动脉狭窄）和2肾2夹型（两侧肾完整，两侧肾动脉狭窄），常用动物是狗和大鼠。2、内分泌性高血压模型 常用大鼠，包括DOC盐性高血压模型、肾上腺再生性高血压模型。3、神经原性高血压模型。4、遗传性高血压模型， 根据采用的遗传学方法进行分类：①选择性近亲繁殖高血压模型（如自发性高血压大鼠SHR、Dahl盐敏感大鼠DS、米兰种高血压大鼠 MHS、遗传性高血压大鼠 GH、以色列种高血压大鼠 SBH、里昂种高血压大鼠 LH）②基因工程高血压模型 高血压转基因动物（transgenic animals of hypertension）、高血压基因敲除动物（geneknockout animals of hypertension）。

研究降压药作用机理的实验方法包括:中枢降压(毁髓猫或大鼠模型、减弱神经反射性调节实验等)；