生物化学实验之-- 生物化学实验之--

实验三

凝胶过滤法使蛋白质脱盐

山东师范大学生命科学学院

【实验目的】 实验目的】学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术

【实验原理】 实验原理】凝胶层析又称分子筛层析、 凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤， 是以凝胶为载体，根据蛋白质的 凝胶过滤 ， 是以凝胶为载体 根据蛋白质的 大小和形状， 大小和形状 ， 即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。 分离和纯化。 该方法广泛用于生物大分子的分离、 该方法广泛用于生物大分子的分离 、 纯 化、浓缩等。 浓缩等。

凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖( 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 类物质，用它来进行物质分离， 糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。 的排阻效应实现的。

葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex,它具有三维空间的 ， 多孔网状结构，呈珠状颗粒。 多孔网状结构，呈珠状颗粒。

本实验用G-25使蛋白质与 使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当 分离， 本实验用 使蛋白质与 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时， 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的 (NH4)2SO4扩散进入 扩散进入G-25的网孔中，而大分子的 的网孔中， 的网孔中 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中， 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时， 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动， 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动， 首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散 首先被洗脱下来，而小分子的 进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到 进出凝胶颗粒的网孔之中， 阻滞力较大，在层析柱中移动较慢， 阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质 很容易地分离开， 与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质 样品脱盐的目的。 样品脱盐的目的。

凝胶过滤层析过程示意图

【器材与试剂】 器材与试剂】(一)器材 1. 层析柱 (15mm×300mm) × ) 2. 铁架台 3. 滴定管夹 4. SephadexG-25 - 5. 刻度吸管 (二)试剂 1. 样品溶液 蛋白质- 蛋白质-硫酸铵溶液 2.10%黄柳酸 % 3.钠氏试剂 钠氏试剂 4.洗脱液(去离子水) 洗脱液( 洗脱液 去离子水)

【实验操作】 实验操作】

(一)凝胶的溶胀 取Sephadex G-25, 加入去离子水置室 - , 温溶胀 24小时 小时 以上， 以上，反复倾 泻去掉细颗粒

, 泻去掉细颗粒， 或沸水浴中煮沸 2~3小时，可去 小时， ~ 小时 除颗粒内部的空 气及灭菌。 气及灭菌。

(二)连接层析装置先将层析柱垂直固定在铁架台上。 1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 按下图将各部位连接起来。 2. 按下图将各部位连接起来。连 接 软 管

洗 脱 液

层 析 柱

连 接 软 管

收 集 容 器

(三)装柱与层析1.装柱 1.装柱 向层析柱中注入少量洗 脱液(去离子水), ),将凝胶 脱液(去离子水),将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中 注满)。 )。凝胶自然沉积约 (注满)。凝胶自然沉积约 1~2cm 高度后打开下端出 水口, 水口,待凝胶床面上升到约 3/4柱高停止 关闭出水口, 柱高停止。 3/4柱高停止。关闭出水口, 静置。 静置。

2.洗柱 2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层 析柱接通，然后拧松螺旋夹， 析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实( 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实(此步也称 作平衡)。适当时间后( )。适当时间后 作平衡)。适当时间后(流下的洗脱液体积一般 。 为柱床体积的2~ 倍),再拧紧螺旋夹 再拧紧螺旋夹。 为柱床体积的 ~3倍),再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。 洗柱过程中注意调整流速约 。

3.加样与洗脱

用刻度吸管吸取1ml样品 ( 蛋白质 - 硫酸 样品( 蛋白质- 用刻度吸管吸取 样品 铵溶液) 铵溶液 ) , 其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面 之上， 慢慢将样品加到凝胶床面上( 之上 ， 慢慢将样品加到凝胶床面上 ( 不可搅动 床面) 床面 ) , 此时能看到床面上样品与洗脱液之间 有一清晰界面。 拧松螺旋夹， 有一清晰界面 。 拧松螺旋夹 ， 待样品全部进入 凝胶柱中, 接通洗脱液， 凝胶柱中 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出 液。

4.收集检查 收集检查 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 用刻度离心管收集洗出液，每管收集 。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 (1)取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠 )取洗出液 滴加入白瓷板穴中， 滴加入白瓷板穴中 氏试剂1滴 如有铵盐洗脱下来， 氏试剂 滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。 滴置小试管中， (2)取洗出液 滴置小试管中，加入磺柳酸 )取洗出液2滴置小试管中 1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉 滴 如有蛋白质洗脱下来， 淀出现。 淀出现。

1)NH4+检查 )

2)蛋白质检查 )