第27卷第5期

2008年9月

食品与生物技术学报

Vol.27 No.5Sep. 2008

文章编号:1673-1689(2008)05-0027-06

PScgpd1启动子融合GUS基因在

酿酒酵母中的瞬时表达

王俊杰1,2, 饶志明*1,2, 沈微1,2, 方慧英1,2, 诸葛健1,2

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;2.江南大学生物工程学院,江苏无锡214122)

摘 要:利用PCR技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因gpd1启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母Saccharomycescerevisiae基因工程菌分别在012,015,110mol/LNaCl的盐胁迫下培养,首次通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GUS报告基因的瞬时表达酶活检测gpd1启动子的酶活表达。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因gpd1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异。证实了gpd1启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道。关键词:甘油代谢;gpd1启动子;B-葡糖苷酸酶中图分类号:Q939.97

文献标识码:A

AnalysisofPromotergpd1oftheKeyGeneofGlycerolMetabolic

inSaccharomycescerevisiaatDifferentOsmoticStress

WANGJun-jie1,2, RAOZh-iming*1,2, SHENWei1,2, FANGHu-iying1,2, ZHUGEJian1,2

(1.KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China;2.SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)

Abstract:AshuttlevectorpYX212-zeocin-PScgpd1-GUShadbeenconstructedandtransformedintoSaccharomycescerevisiaebyelectroporation.Thetransformantswasculturedinmediumwith012,015and110mol/LNaClsupplement,respectively.Theenzymeactivityofpromotergpd1wasdeterminedbytransienthistochemicalanalysisofGUSgeneatdifferentosmoticpressure.Theresultshowedthattheexpressionofpromotergpd1inS.cerevisiaeatdifferentosmoticpressurewereprominentlydifferent.Itwasconcludedthatthepromotergpd1wasaninduciblepromoter,regulatedbyosmoticpressure.Keywords:glycerolmetabolic;promotergpd1;GUS

收稿日期:2007-07-25.

基金项目:国家自然科学基金项目(30570142,20676053);国家863计划项目(2006AA020103);江苏省青年科技

创新人才基金项目(BK2006504);长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0532).

作者简介:王俊杰(1983-),男,湖北武汉人,微生物学硕士研究生.

*通讯作者:饶志明(1975-),男,江西临川人,农学博士,教授,硕士生导师.主要从事工业微生物育种及分子生物

学改造方面的研究.Email:raozm@http://

28食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷

zeocin,p3300-zeocin由作者所在实验室保藏。11112 工具酶和试剂 限制性内切酶HindIII、BamHI、BglII、SalI,T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶等购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒,小型DNA片断回收试剂盒购自博大泰克公司;氨苄西林,卡那霉素,Zeocin等抗生素购自上海生物工程有限公司;GUS基因的底物X-gluc,4-甲基伞形酮酰-b-葡萄糖醛苷(4-methylumbellifery-lb-D-glucu-ronide,MUG),4-甲基伞形酮(4-methylumbellifer-one,MU)均购自上海生物工程有限公司。11113 PCR引物 根据酿酒酵母S1cerevisiae303-1A基因组和质粒pBI121公布的序列,分别设计基因片段PScgpd和GUS合成PCR所需引物(上海赛百盛基因技术有限公司合成):

P1:5c-GCACGAAATATAT-GTAGGCAA-3c;

P1:5cATTTGTGTT-TGTGGAGG-3c;

P3:5cCGGATGATATA-CTGACGTAC-3c;P4:5cCCAATATATTAAA-GCGCAGTTA-3c

引物1,2,3,4分别在引物上游引入BglÒ,BamHI,BamHI,HindIII酶切位点(下划线部分)。112 方法

11211 菌体的培养 将含有重组质粒pYX212-zeocinE1coliJM109,在含有50mg/LkanaLB固体或液体培养基中,250r/min、37e培养过夜。含重组质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS的酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌在含150mg/mLzeocin的YPD固体或液体培养基中于250r/min、30e培养过夜。

11212 染色体DNA制备 参照文献[9]进行。11213 PCR反应体系及反应条件 反应体系:10@buffer5LL,215mmol/LdNTP4LL,MgCl24LL,两条引物各1LL,模板DNA2LL,Taq酶1LL,ddH2O33LL,总体积50LL。PScgpd1PCR反应条件:94e预变性5min,变性60s,55e退火90s,72e延伸120s,30次循环后,72e保温10e。GUS基因PCR反应条件:94e预变性5min,变性60s,52e退火90s,72e延伸120s,35次循环后,72e保温10e。

另外,PCR产物胶回收,Pscgpd1和GUS与pMD-18TEasyvector连接、转化及质粒提取均参照 甘油(glycerol)是甘油三酸酯分子的骨架成分;它具有相对分子量小、容易溶解,在生理pH值范围内不带净电荷,能被细胞膜保持住,对生物细胞无任何毒副作用等特点,因此被认为是一种极其理想的耐高渗透压介质。在真核生物中,存在于胞浆中的3-磷酸甘油脱氢酶,以NAD+为辅酶,催化磷酸二羟丙酮生成3-磷酸甘油,然后3-磷酸甘油磷酸酶催化3-磷酸甘油生成甘油。当环境渗透压升高时,酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡

[1]

,但是其分子内部作用机理尚未

[2-4]

研究清楚。经研究发现,3-磷酸甘油脱氢酶

(GPDH)至少有两个同工酶,分别为gpd1、gpd2,

且生物体内甘油合成代谢中以gpd1为主;GPDH作为生物体内甘油合成代谢途径中的限速酶,直接决定了葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成方向的物质流分配量和甘油合成水平。赵有玺等克隆到产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因gpd1,并将其在酿酒酵母中表达,发现甘油合成量有显著的提高;陈献忠等

[7]

[5]

[6]

从一株产甘油假丝酵母的工业菌

种中成功克隆到GPDH的编码基因Cggpd的上下游序列,在一定的盐胁迫下将该基因在其它的酵母中异源表达,发现携带Cggpd基因的转基因酵母比野生型的酵母有明显的耐渗透压胁迫的能力。但是,甘油含量的提高与GPD基因内部的之间的作用机理也未研究透彻,且gpd1基因的启动子与甘油含量的积累之间的研究未见报道。

利用基因融合来研究现代分子生物学的问题,如基因表达、调控等是非常有效的,GUS(B-葡糖苷酸酶)基因是从大肠杆菌中克隆的,作为基因融合系统中的报告基因广泛应用于细菌、植物、甚至动物的基因调控、表达等分子遗传学的研究中

[8]

。作

者从酿酒酵母S1cerevisiae中克隆gpd1的启动子,并构建真核生物穿梭表达载体pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转化入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌分别在不同NaCl浓度的盐胁迫下培养,通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GUS报告基因的瞬时表达酶活检测gpd1启动子的功能,作者研究酵母甘油代谢关键酶基因gpd1启动子在不同渗透压下的表达水平。

1 材料与方法

111 材料

11111 菌株及质粒 酿酒酵母Saccharomycescer1-

第5期王俊杰等:PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达29

11214 酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌的构建

1)酿酒酵母S1cerevisiae表达载体的构建:首先将PCR来源于酿酒酵母染色体和载体pBI121的目的基因PScgpd1和GUS分别连入载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-PScgpd1,PMD-18T-GUS。然后分别用BglÒ,BamHI及BamHI,HindIII双酶切重组质粒PMD-18T-

PScgpd1,PMD-18T-GUS,分别得到111kb和211kb的目的基因PScgpd1及GUS,并将其依次连入表达载体pYX212-zoecin,得到重组表达载体pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,见图1。随后将连

接产物转化E1coliJM109。挑取转化子,提取重组质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS经PCR和酶切验证,见图2。

图1 质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS的构建

Fig.1 ConstructionofrecombinantplasmidpYX212-zeocin-PScgpd1-GUS

2)重组质粒电击转化酿酒酵母 加5LL的酵母表达载体pYX212--zeocin-PScgpd1-GUS质粒于

移至无菌预冷的电击杯中(电击间距为011cm)。迅速吸干电击杯表面的水,将电击杯放入点转仪的

30食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷

内单位蛋白质产生4-methlumbelliferone(MU)的量比较各启动子对GUS基因表达的影响,每个梯度做3个平行对照,取各梯度的平均值进行比较。

杯,迅速加入1mLLB液体培养基混匀,并转移至115mL的离心管中。在28e下振荡孵育培养3h,离心1min,取下层悬浮菌液涂布于含相应质量浓度zoecin的选择培养基上,28e培养2~3d。将

得到的重组转化子提取重组质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,并进行酶切验证[10]。

11215 SDS-PAGE 采用5g/dL浓缩胶及12g/dL分离胶的不连续垂直平板电泳进行蛋白质分离,考马斯亮蓝G-250染色,以酿酒酵母S1cerevisiaeW30321A作为对照

[11]

2 结果与分析

211 T-GPD和T-GPP的构建

通过PCR成功扩增了PScgpd1与GUS基因,

将PScgpd1与GUS基因分别与pMD-18TEasyvector连接,转化E1coliJM109。挑取白色转化子,过夜培养,提取质粒。然后用EcoRI酶切验证质粒,酶切有217kb和111kb左右条带的为T-PScgpd1阳性克隆,酶切有217kb和211kb左右条带的为T-GUS阳性克隆,见图2

。

。

11216 GUS的瞬时表达

1)GUS的组织化学染色:提取含质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS

酿

酒

酵

母

S1cerevisiae基因工程菌的转化子接种于YPD培养基中,培养8h后,以非基因工程菌作为对照,于30e培养18~24h。取培养好的转基因酵母培养液10mL,离心收集细胞,置于20mL固定液V(95%的乙醇)BV(冰醋酸)=3B1,室温下固定酵母细胞30min,离心收集细胞,然后将细胞浸泡于染色液(50mmol/LPBS缓冲液,5mmol/L铁氰化钾,5mmol/L亚铁氰化钾,013g/dLX-葡萄糖醛酸苷酸和015g/dLTritonX-100)中,37e下保温过夜,显微镜下观察。

2)GUS的荧光法测定:提取含质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌的转化子,培养8h后,分别接种在添加有012,015,110mol/LNaCl的YPD培养基中,分别以非基因工程菌和不加NaCl胁迫培养的基因工程菌作为对照,于30e培养18~24h。取培养好的转基因酵母培养液10mL,离心收集细胞,置于20mLGUS提取溶液(50mmol/LNa3PO4,pH710,10mmol/LNa2EDTA,011g/dLTritonX-100,10mmol/LB-巯基乙醇,011g/dL十二烷基肌酸纳)中,与400W超声波破碎20min,用115mL的Ep-pendorf离心管在小型离心机上离心破碎5min;分别将100LL上清液转移到2个试管中,一个标记为0,一个为60;向标记为0的试管中加入900LL的终止液;将2个试管放到冰浴上,加入100LL的检测溶液(提取液中含有1mmol/L的4-甲基伞形酮酰-b-葡萄糖醛苷,MUG);轻轻摇动试管将溶液混匀,将标有60的试管放在37e水浴中1h;60min后,向标有60的试管中加入900LL的终止液(012mmol/LNa2CO3);在激发光365nm、发射光455nm下测各样品的荧光,以反应终止液为空白溶液,用荧光仪测定甲基伞酮(MU)的浓度。以单位时间

M1.KDNA/HindÓmarkers;1.DoubledigestionofpMD-18T-PScgpd1byBglÒandBamHI;2.DoubledigestionofpMD-18T-GUSbyBamHIandHindIII

图2 pMD-18T-PScgpd1,pMD-18T-GUS酶切验证Fig.2 RestrictionmapofpMD-18T-PScgpd1andpMD-18T-GUS

212 酿酒酵母S1cerevisiae表达载体的构建

挑取转化子,提取重组质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,经PCR分别得到PScgpd1-GUS基因片段约111kb和GUS基因片段约211kb;同时用SacI和HindIII双酶切,得到质粒的两个片段分别为1016kb和312kb,这与连接前的基因片段大小是一致的,见图3。

213 酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌的获得

将重组构建得到的酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌表达载体pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS电击转化酿酒酵母,将电击后的悬浮菌液涂布于含150mg/mLzoecin的YPD固体选择培养基上,30e静置培养2~3d。挑取转化子,接种于150mg/mLzoecin的YPD液体选择培养基中,在250r/min30e下培养18~20h,提取重组质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,用SacI和HindIII双酶切质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS,得到两个片段6

第5期王俊杰等:PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达31

酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌已经构建成功,见图4。

中PScgpd1启动子成功的启动了GUS基因的表达。

M1.KDNA/HindÓmarkers;1.ProductionPScgpd1ofPCRfromplasmidofpYX212-zeocin-PScgpd1-GUS;2.ProductionGUSofPCRfromplasmidofpYX212-zeocin-PScgpd1-GUS;3.pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS/EcoRÑ;4.Doublediges-tionofpYX212-zeocin-PScgpd1-GUSbySacIandHindIII;M2.DL2000markers.

1.S.cerevisiaeW30321/pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS;2.S.cerevisiaeW30321A(control);M.Proteinmarkers(kDa)

图5 重组菌全细胞蛋白SDS2PAGE电泳分析Fig.5 SDS-PAGEanalysisofproteinsinwholecells

图3 质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS的PCR及酶

切验证

Fig.3 AnalysisofplasmidofpYX212-zeocin-PScgpd1-GUSbyPCRand

digestion

a.酿酒酵母S1cerevisiae;b.酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌

图6 不同渗透压下GUS基因的瞬时瞬时组织化学染

色

Fig.6 TransienthistochemicalanalysisofGUSgeneun-M1.KDNA/HindÓmarkers;1.pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS/EcoRÑ;2.DoubledigestionofpYX212-zeocin-PScg-pd1-GUSbySacIandHindIII;M2.DL2000markers

derdifferentosmoticpressure

由于表达载体pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS

中,GUS融合蛋白基因的表达由gpd1启动子驱动GUS报告基因的表达,因此通过GUS基因的瞬时组织化学染色法分析GUS报告基因的表达水平,可以间接反应出gpd1启动子的表达水平的情况。从图7可见,当无渗透压胁迫,即在没有NaCl盐胁迫处理的情况下,转基因酵母内的GUS活性不及经盐胁迫处理后的高,且在一定胁迫范围内GUS的活性随着胁迫力度的加大而上升,018mol/LNaCl盐胁迫时达到最高。但是由于酿酒酵母的抗渗透压胁迫能力有限,因此NaCl胁迫处理力度的进一步加大使细胞开始死亡,并且不启动GUS基因。综上所述,可以充分说明,在盐胁迫处理条件下,酵母菌内的PScgpd1启动子的表达明显强于未经胁迫处理的酵母菌,且PScgpd1启动子是受盐胁迫调控的诱导型启动子。

图4 酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌的验证Fig.4 ConfirmationofS1cerevisiaetransformants

214 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE电泳分析将重组酿酒酵母S1cerevisiaeW303-1A/pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS离心收集菌体,超声波破壁,进行SDS-PAGE全细胞蛋白质电泳分析,见图5。以酿酒酵母S1cerevisiaeW303-1A为对照,发现重组酵母在64000处出现蛋白质特征带,与文献报道的目的蛋白质大小相符。215 渗透胁迫对GPD1启动子表达的影响从图6可见,经过GUS基因的组织化学染色后,非基因工程菌完全没有蓝色沉淀,即无GUS表达(图6a);同时,转入了质粒pYX212-zeocin-PScg-pd1-GUS的转基因酿酒酵母S1cerevisiae,染色后

32食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷

以提高生物体对外界环境的耐受能力。作者利用PCR方法成功克隆到酿酒酵母S1cerevisiaeW303-1A甘油代谢关键酶基因gpd1启动子,构建了真核生物穿梭表达载体pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并通过电击转化的方法将其电击转化入酿酒酵母S1cerevisiae

W303-1A

中得到酿酒酵母

S1cerevisiaeW303-1A/pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS基因工程菌。将构建成功的酿酒酵母S1cerevisiae

图7 不同NaCl浓度胁迫下GUS表达活性

W303-1A/pYX212-zeocin-PScgpd1-

Fig.7 GUSactivityunderdifferentNaClosmoticstress

GUS基因工程菌分别在012,015,110mol/LNaCl的盐胁迫下培养,通过GUS组织化学染色法

测定GUS报告基因的瞬时表达酶活来检测gpd1启动子的表达情况。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因gpd1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异,且随着盐胁迫力度的加大,gpd1表达量也相应增加,证实了gpd1启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子。

3 结 语

PScgpd1启动子为酵母内甘油代谢主要关键限速酶gpd1的启动子,决定着该酶基因的表达,而甘油又是良好的耐渗透压调节剂,过量的合成甘油可

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