第27卷第5期

2008年9月

食品与生物技术学报

Vol.27 No.5Sep. 2008

文章编号:1673-1689(2008)05-0027-06

PScgpd1启动子融合GUS基因在

酿酒酵母中的瞬时表达

王俊杰1,2, 饶志明*1,2, 沈微1,2, 方慧英1,2, 诸葛健1,2

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;2.江南大学生物工程学院,江苏无锡214122)

摘 要:利用PCR技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因gpd1启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母Saccharomycescerevisiae基因工程菌分别在012,015,110mol/LNaCl的盐胁迫下培养,首次通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GUS报告基因的瞬时表达酶活检测gpd1启动子的酶活表达。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因gpd1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异。证实了gpd1启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道。关键词:甘油代谢;gpd1启动子;B-葡糖苷酸酶中图分类号:Q939.97

文献标识码:A

AnalysisofPromotergpd1oftheKeyGeneofGlycerolMetabolic

inSaccharomycescerevisiaatDifferentOsmoticStress

WANGJun-jie1,2, RAOZh-iming*1,2, SHENWei1,2, FANGHu-iying1,2, ZHUGEJian1,2

(1.KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China;2.SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)

Abstract:AshuttlevectorpYX212-zeocin-PScgpd1-GUShadbeenconstructedandtransformedintoSaccharomycescerevisiaebyelectroporation.Thetransformantswasculturedinmediumwith012,015and110mol/LNaClsupplement,respectively.Theenzymeactivityofpromotergpd1wasdeterminedbytransienthistochemicalanalysisofGUSgeneatdifferentosmoticpressure.Theresultshowedthattheexpressionofpromotergpd1inS.cerevisiaeatdifferentosmoticpressurewereprominentlydifferent.Itwasconcludedthatthepromotergpd1wasaninduciblepromoter,regulatedbyosmoticpressure.Keywords:glycerolmetabolic;promotergpd1;GUS

收稿日期:2007-07-25.

基金项目:国家自然科学基金项目(30570142,20676053);国家863计划项目(2006AA020103);江苏省青年科技

创新人才基金项目(BK2006504);长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0532).

作者简介:王俊杰(1983-),男,湖北武汉人,微生物学硕士研究生.

*通讯作者:饶志明(1975-),男,江西临川人,农学博士,教授,硕士生导师.主要从事工业微生物育种及分子生物

学改造方面的研究.Email:raozm@http://

28食 品 与 生 物 技 术 学 报 第27卷

zeocin,p3300-zeocin由作者所在实验室保藏。11112 工具酶和试剂 限制性内切酶HindIII、BamHI、BglII、SalI,T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶等购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒,小型DNA片断回收试剂盒购自博大泰克公司;氨苄西林,卡那霉素,Zeocin等抗生素购自上海生物工程有限公司;GUS基因的底物X-gluc,4-甲基伞形酮酰-b-葡萄糖醛苷(4-methylumbellifery-lb-D-glucu-ronide,MUG),4-甲基伞形酮(4-methylumbellifer-one,MU)均购自上海生物工程有限公司。11113 PCR引物 根据酿酒酵母S1cerevisiae303-1A基因组和质粒pBI121公布的序列,分别设计基因片段PScgpd和GUS合成PCR所需引物(上海赛百盛基因技术有限公司合成):

P1:5c-GCACGAAATATAT-GTAGGCAA-3c;

P1:5cATTTGTGTT-TGTGGAGG-3c;

P3:5cCGGATGATATA-CTGACGTAC-3c;P4:5cCCAATATATTAAA-GCGCAGTTA-3c

引物1,2,3,4分别在引物上游引入BglÒ,BamHI,BamHI,HindIII酶切位点(下划线部分)。112 方法

11211 菌体的培养 将含有重组质粒pYX212-zeocinE1coliJM109,在含有50mg/LkanaLB固体或液体培养基中,250r/min、37e培养过夜。含重组质粒pYX212-zeocin-PScgpd1-GUS的酿酒酵母S1cerevisiae基因工程菌在含150mg/mLzeocin的YPD固体或液体培养基中于250r/min、30e培养过夜。

11212 染色体DNA制备 参照文献[9]进行。11213 PCR反应体系及反应条件 反应体系:10@buffer5LL,215mmol/LdNTP4LL,MgCl24LL,两条引物各1LL,模板DNA2LL,Taq酶1LL,ddH2O33LL,总体积50LL。PScgpd1PCR反应条件:94e预变性5min,变性60s,55e退火90s,72e延伸120s,30次循环后,72e保温10e。GUS基因PCR反应条件:94e预变性5min,变性60s,52e退火90s,72e延伸120s,35次循环后,72e保温10e。

另外,PCR产物胶回收,Pscgpd1和GUS与pMD-18TEasyvector连接、转化及质粒提取均参照 甘油(glycerol)是甘油三酸酯分子的骨架成分;它具有相对分子量小、容易溶解,在生理pH值范围内不带净电荷,能被细胞膜保持住,对生物细胞无任何毒副作用等特点,因此被认为是一种极其理想的耐高渗透压介质。在真核生物中,存在于胞浆中的3-磷酸甘油脱氢酶,以NAD+为辅酶,催化磷酸二羟丙酮生成3-磷酸甘油,然后3-磷酸甘油磷酸酶催化3-磷酸甘油生成甘油。当环境渗透压升高时,酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡

[1]

,但是其分子内部作用机理尚未

[2-4]

研究清楚。经研究发现,3-磷酸甘油脱氢酶

(GPDH)至少有两个同工酶,分别为gpd1、gpd2,

且生物体内甘油合成代谢中以gpd1为主;GPDH作为生物体内甘油合成代谢途径中的限速酶,直接决定了葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成方向的物质流分配量和甘油合成水平。赵有玺等克隆到产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因gpd1,并将其在酿酒酵母中表达,发现甘油合成量有显著的提高;陈献忠等

[7]

[5]

[6]

从一株产甘油假丝酵母的工业菌

种中成功克隆到GPDH的编码基因Cggpd的上下游序列,在一定的盐胁迫下将该基因在 …… 此处隐藏：8826字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……