632复旦学报(医学版) 2010年11月,37(6)

基质细胞来源有限,难以获得大量有活性的种子细胞,寻找新的种子细胞来源已成为角膜组织工程的研究热点。脂肪干细胞(adiposederivedstemcells,ASCs)作为来源于脂肪组织的一种成体干细胞,与骨髓基质干细胞一样,具有不断自我更新和多向分化的潜能,已被证明具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造

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血和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。本研究采用兔脂肪干细胞作为种子细胞,复合可降解生物材料PLGA(rASCs PLGA)构建组织工程兔角膜基质,观察其对兔角膜基质缺损的修复情况,旨在为角膜基质的组织工程修复提供新的种子细胞来源和实验依据。

入新的含10%EBS的DMEM液,平均分配至多个新的培养皿继续培养。细胞传代至第4代待用。

制备PLGA材料 以氯仿为溶剂,配制0.05g/mLPLGA溶液,充分溶解后以9%1(NaCl%PLGA)的比例加入NaCl颗粒,充分搅拌使NaCl均匀分散,所得悬浮液快速倒入模具中,常温干燥48h,脱模后用蒸馏水洗去多孔膜中的NaCl,空气干燥48h,再放入40 烘箱干燥24h。美康硬性隐形眼镜两片,夹持盐析膜,放置于37 烘箱静置24h,裁剪成直径7mm的圆形材料备用。

制备细胞 材料复合物 将第4代rASCs用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后收集在50mL离心管,1500r/min离心5min,弃上清,10%FBS的DMEM培养基重悬,计数。按1&107/mL的密度接种细胞到已制备的PLGA材料上,使细胞悬液均匀浸满于支架材料上,置于细胞培养箱中,4h后添加含10%FBS的DMEM培养液。ASCs接种于PLGA后,每天倒置相差显微镜观察细胞在生物支架中的生长、增殖、基质分泌和细胞形态变化。取培养第7天的细胞 PLGA复合物,PBS洗涤,2.5%的戊二醛固定24h,50%、70%、80%、90%及100%乙醇溶液梯度脱水,醋酸正戊酯置换,CO2临界点干燥,离子喷射仪喷金,扫描电镜观察。

制作兔角膜基质缺损模型并构建组织工程角膜基质 兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)全麻平稳后,常规消毒铺巾,开睑器开睑,手术显微镜下使用眼科角膜隧道刀制作直径8mm、1/3角膜厚度的带蒂角膜基质瓣,切除其下直径7mm、1/3厚度的角膜基质层,植入直径7mm的rASCs PLGA复合物,复位基质瓣并予10 0缝线间断缝合。手术由同一经验丰富的眼科医师操作完成。术后2周林可霉素滴眼液点术眼,每日3次,每晚红霉素眼膏涂眼,术后持续观察6个月。对照组采用与实验组相同的手术方法,在角膜基质缺损层间植入未接种细胞的空白PLGA材料,同样观察6个月。

活体和组织学动态观察 术后1~7天、2周、1个月、3个月、6个月裂隙灯显微镜观察兔眼角膜愈合情况,注意角膜新生血管生长、植片有无脱落、角膜透明度恢复情况。分别于术后3个月和6个月处死实验组和对照组兔并取材,取兔角膜固定于4%多聚甲醛溶液24h,常规脱水后,石蜡包埋封片,行组织学切片,苏木精 伊红(HE)染色。

超微结构观察 分离获取第6个月实验组新生角膜基质组织和正常兔角膜基质组织,分别置于2.5%戊二醛液中固定24h、1%锇酸液固定1h后,,材料和方法

实验动物 3月龄雌性新西兰大白兔24只,体重1.5~2.5kg,由上海交通大学农学院提供。随机分为2组,每组12只。实验组:每只兔选取1眼植入rASCs PLGA复合材料;对照组:植入未接种细胞的PLGA材料。由计算机产生随机数,若<0.5,则左眼植入,若>0.5,则右眼植入。实验前裂隙灯显微镜检查兔眼前节无异常。

主要实验仪器和试剂 CO2细胞培养箱(美国Forma公司);培养皿(美国Corning公司);50mL离心管(美国Falcon公司);低速离心机(美国Biofuge公司);倒置相差显微镜(日本Olympus公司);扫描电镜(PhilipsQuanta200FEI);透射电镜(H2500,日本Hitachi公司);DMEM培养液(美国Gibico公司);胎牛血清FBS(澳大利亚JRH公司);L 谷氨酰胺300g/mL、胰蛋白酶(上海实生生物技术有限公司);抗坏血酸50mg/mL、氯仿、NaCl(国药集团化学试剂有限公司);青、链霉素各100IU/mL(华北制药有限公司);#型胶原酶(美国Sigma公司);PLGA(济南健宝开元生物材料有限公司)。

自体兔脂肪干细胞(rASCs)的分离培养 新西兰大白兔12只,雌性,体重1.5~2.5kg。戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉,无菌条件下取兔颈背部皮下脂肪,PBS冲洗后剪碎,0.1%的#型胶原酶37 震荡消化45min,2000r/min离心10min并倾去上清液,将细胞重悬于含10%FBS的DMEM培养基,接种于培养皿中。置于37 、CO2体积分数为5%、湿度为100%的培养箱中孵育,48h后首次换液,以后每3天更换一次培养液。待细胞生长达到80%~90%融合时,PBS液洗涤,加入0.25%胰蛋白酶1.0mL,37 下消化约3min,在倒置相差显微镜下观察到多数细胞皱,,r/