高效液相色谱法测定甘蔗节间果糖、葡萄糖和蔗(2)

※分析检测食品科学

2011, Vol. 32, No. 02

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谱法等[7-8]、液相色谱法[9-11]。一般化学法只能测定各种糖的总量而不能分别测定各种糖的含量[12]，并且，有研究表明，测得的葡萄糖、果糖值比实际值略高[13]，极有可能影响甘蔗品质的判断。气相色谱法虽可分别测定不同糖的含量，灵敏度高，但由于糖类化合物沸点高，难以汽化，必须进行衍生化反应才可检测[14-15]，这使检测步骤繁琐，误差较大。目前，采用高效液相色谱法分析检测不同糖含量在蜂蜜、菠萝、马铃薯等中已有不少报道

[16-18]

，甘蔗节间糖含量测定目前报道主要

采用一般的化学方法，本实验采用碳水化合物分析专用柱对甘蔗节间糖分进行分离分析，建立一种简便、快速和准确可靠的，能同时测定果糖、葡萄糖、蔗糖含量的高效液相色谱法。1材料与方法1.1材料

样品均采自福建农林大学农业部甘蔗所甘蔗种植园区。1.2

试剂与仪器

葡萄糖、果糖、蔗糖标样为国产色谱纯(纯度均不低于99.5%)，乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

1100型高效液相色谱仪(具有示差折光检测器和针孔进样器) 美国安捷伦公司。1.3

色谱分析条件

Agilent Zorbax carbohydrate柱(4.6mm×250mm，5.0μm)；流动相为乙腈-水(75:25，V/V)；柱温30℃；检测池温度35℃；流速1.0mL/min，进样量20μL。1.4

糖标准溶液的配制

准确称取果糖、葡萄糖、蔗糖各2.0g(精确到0.0001g)，转移至100mL容量瓶中，用高纯水定容至刻度，得到各自质量浓度均为20mg/mL的混标溶液。逐级稀释至10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL。上机进样分析前经0.45μm微孔滤膜过滤。每个样品重复3次。1.5

样品处理

将冷冻的节间样品去皮，切碎，在液氮中磨成粉末状，精确称取样品粉末1.00g(精确到0.0001g)，加入80%的乙醇5mL，80℃恒温水浴30min后，12000r/min离心20min，取上清液，残渣加入5mL 80%的乙醇溶液重复提取1次，合并提取上清液，90℃水浴中蒸干乙醇，加入高纯水定容至5mL，混匀后用一次性注射器抽取提取样液，经0.45μm微孔滤膜过滤后以备上机进样分析。每个样品重复3次。2结果与分析2.1

样品前处理

水和乙醇均是良好的糖类物质提取剂，比较常用的超声波水提方法、乙醇恒温水提方法的提取效果。结果表明：用乙醇作为样品提取溶剂时，分离效果、分离速度、准确度、回收率上优于用水作为样品提取溶剂。提取后的甘蔗样品在12000r/min转速以上可以沉淀悬浮物。2.2色谱条件的优化2.2.1

流动相的选择

本实验采用Agilent Zorbax carbohydrate柱以乙腈-水比例为85:15、80:20、75:25、70:30(V/V)不同比例的流动相测定糖混合标准品和甘蔗提取液中各种糖成分的含量和分离情况。实验证明提高流动相中水的比例可以加快分离过程，但也会造成其中果糖和葡萄糖色谱峰的重叠，随着乙腈体积分数的增加，甘蔗提取液中糖分离程度提高，当流动相中乙腈和水的体积比为85:15时分离效果最佳，但是保留时间较长。当流动相中乙腈和水的体积比为75:25时分离效果也很好，相邻峰的分离度较好，且保留时间较短，12min就可以分析一个样品，在兼顾分离速度和分离效果的基础上，本实验采用流动相为乙腈和水的比例为75:25。2.2.2

色谱柱柱温的选择

比较色谱柱温度在25、28、30、35℃条件下糖混合标准品和甘蔗提取液中各种糖成分的含量和分离情况。结果发现随着温度的降低，甘蔗提取液中糖分离程度提高，但是保留时间较长，35℃时，分离速度最快，但分离程度降低，并且柱温高会减少色谱柱的寿命，考虑到以上因素，本实验采用色谱柱柱温为30℃。2.2.3

流动相流速的选择

在0.8～1.2mL/min范围内改变流动相流速，发现在流速为1.0mL/min时，3种糖出峰时间合适，峰形较好。2.3

标准曲线的制作

取果糖、葡萄糖、蔗糖各级标准溶液(20、10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL)，进样20μL，以标样峰面积y为纵坐标、标样质量浓度x为横坐标，绘制标准溶液曲线，得线性回归方程，结果见表1，图1为某级标样色谱图。

表1 标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围Table 1 Regression equations, correlation coefficients and linear

ranges for sucrose, glucose and fructose

组分

线性回归方程

相关系数线性范围/(mg/mL)果糖y=209595.08468x+48069.26570.999520.625～20葡萄糖y=174657.92718x－3352.318520.999720.625～20蔗糖

y=209990.14148x+96915.1032

0.99827

0.625～20