米非司酮诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡机制的研究

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米非司酮诱导人宫颈癌 Hela 细胞凋亡机 制的研究(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)

【摘要】

目的 探讨米非司酮 (MIF) 对人宫颈癌 Hela

细胞的凋亡诱导作用及作用机制。方法 体外培养人宫颈癌 Hela 细 胞，流式细胞技术分析不同浓度米非司酮对 Hela 细胞凋亡率及细胞 周期分布的影响， 用 Western blot 法检测米非司酮对 Hela 细胞中 NFκB p65 蛋白表达水平的影响。结果 5、10、20 μmol/L 的米非司酮 均能使 Hela 细胞凋亡率明显增加，使 S 期、G2/M 期细胞比例减少， G0/G1 期细胞比例显著增加，且作用呈剂量依赖性；随着米非司酮 浓度的增加，Hela 细胞中 NF-κB p65 蛋白表达水平逐渐下降。结论 米非司酮可能通过 NF-κB 信号通路下调 NF-κB p65 蛋白表达，从而 调节细胞周期，诱导 Hela 细胞凋亡。 【关键词】 人宫颈癌；Hela 细胞株；米非司酮；凋亡；细胞周期； NF-κB;p65 Abstract: Objective To investigate the regulatory effect of mifepristone on the cell apoptosis of human cervical cancer cell line

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Hela and the underlying mechanisms. Methods Human cervical cancer cell line Hela was cultured in vitro. Flow cytometry analysis technique was used to determine the changes of cell cycle distribution and cell apoptosis percentage after treatment with different concentrations of mifepristone. Western blot was performed to examine the effect of mifepristone on the expression of NF-κB p65 protein of Hela cell line. Results 5, 10 and 20 μmol/L mifepristone significantly increased the cell apoptosis percentage and the proportion of cells in G0/G1 phase of Hela cells and decreased the proportion of cells in S and G2/M phases in a dose-depending manner. With the increase of mifepristone concentrations, the expression of NF- κ B p65 was gradually downregulated in Hela cells. Conclusion Mifepristone can regulate cell cycle distribution and accelerate cell apoptosis by

downregulating the expression of NF-κB p65 protein in cell line Hela via NF-κB signaling pathway.

Key words: human cervical cancer; cell line Hela; mifepristone; apoptosis; cell cycle; NF-κB; p65

米非司酮(mifepristone,MIF)是人工合成的抗孕激素药物， 目前在临床上主要用于终止早孕、引产等。近年研究发现，米非司酮

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还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等其他临床新用途。核因子-κ B (nuclear factor of kappa binding, NF-κB)是一种具有多向调节功能的 核转录因子，参与细胞的增殖、凋亡和癌基因的转录调控的信号传递 过程，并被证实和宫颈癌的发生发展密切相关[1-2] ,NF-κB p65 则 是 NF-κB 在体内发挥生理功能的主要亚单位之一。本实验的目的是 研究不同

浓度的米非司酮对人宫颈癌 Hela 细胞生长及对 NF-κB p65 蛋白表达的影响， 探讨米非司酮对宫颈癌的治疗作用及其可能的作用 机制，为宫颈癌的防治寻找新途径。 1 材料和方法 1.1 材料 人宫颈癌 Hela 细胞株(中国医学科学院血液学研究所惠赠) , 米非司酮纯粉剂 (浙江仙琚制药股份有限公司惠赠) , DMEM 干粉 (美 国 Gibco 公司) ,碘化丙啶(PI)、MTT(美国 Amersco 公司) ,NF-κ B p65 抗体(碧云天生物技术研究所) 。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 常规复苏冻存的人宫颈癌 Hela 细胞，接种于盛有 DMEM 培养 液(含 10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素、1×105U/L 链霉素)的培 养瓶中，在 37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养，隔日更换新培 养液一次。平均 3~4 天传代一次。 1.2.2 实验分组 将培养的 Hela 细胞随机分为用药组和对照组。用药组：分为 3

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组，分别含有浓度为 5、10、20 μmol/L 的米非司酮，各组 DMEM 培养液中乙醇终浓度小于 0.2%,含有 7%胎牛血清。对照组：培养 液中不含米非司酮，只含与用药组相同浓度的乙醇和胎牛血清。 1.2.3 实验方法 1.2.3.1 流式细胞技术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡率 取对数生长期的 Hela 细胞，制成单细胞悬液，每瓶 4×105 个 细胞接种于 100 ml 培养瓶中，培养 24 h 后观察细胞已贴壁，换新培 养液，分 4 组(如上所述) ,每组设 3 个样本，加入含有不同浓度米 非司酮的培养液，继续培养 72 h 后，制成单细胞悬液，收集细胞于 流式管中，离心(1 500 r/min、5 min)弃上清，PBS 洗涤 2 遍，沿 管壁缓慢加入 70%冰乙醇(4℃)1 ml,使细胞悬浮固定至少 18 h 后，离心弃上清，PBS 洗涤 2 遍，每管加入 PI 1 ml 染色，4℃避光 1 h,置流式细胞仪检测分析。 1.2.3.2 Western blot 法检测 NF-κB p65 的表达 取对数生长期的 Hela 细胞，制成单细胞悬液，以每孔 8×105 个细胞接种于 6 孔培养板中，24 h 后观察细胞已贴壁，分组施加药 物干预。分组情况如上所述，每组重复 3 个孔，继续培养 72 h,收 集细胞，按一种新改进的核蛋白的抽提方法[3]提取核蛋白。将核 蛋白提取液进行蛋白浓度测定后，依次行 SDS-PAGE 电泳、半干转 膜、抗原-抗体反应、显色、拍照。实验过程中，以β-actin 作为内参 进行检测，保证实验结果的准确性。最后用 Image J 图像分析软件 对条带进行分析，测定其灰度值。

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