PCR技术及其发展 和应用张雪梅 检验系临床生化教研室

主要参考书1. CW迪芬巴赫 、GS德弗克斯勒[美]主 编 。《PCR技术实验指南》2. 黄留玉主编。《PCR最新技术原理、方 法及应用》 3. 尹一兵主编。《分子诊断学》

目

录

PCR技术的原理 PCR技术的衍生技术 实时荧光PCR技术 PCR技术的应用

一、PCR的基本原理标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L

PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点

PCR的基本原理

PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点

PCR的基本原理高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 (℃)

PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点

1

2

3

94形 成 DNA 2

重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上

55 22

条变 单性 链

子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性

MOVIE

DNA双螺旋

1

2

3时间(min)

4

5

PCR的基本原理高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 (℃)

PCR反应条件 95℃ PCR过程 PCR的特点

1

2 模板DNA 3

94

重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上

形 成

DNA 2

55 22

条变 单性 链

子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性

DNA双螺旋

1

2

3时间(min)

4

5

PCR的基本原理DNA引物

PCR反应条件 50℃ PCR过程 PCR的特点

引物1

引物2

PCR的基本原理Taq酶DNA引物

PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点

引物1

引物2 Taq酶

PCR的基本原理第1轮结束 第2轮开始

PCR反应条件 95℃ PCR过程 PCR的特点

PCR的基本原理Taq

PCR反应条件 50℃ Taq PCR过程 PCR的特点

Taq

Taq

PCR的基本原理第2轮结束

PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点

模板DNA

PCR的基本原理

第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

第4轮扩增

重复30轮后 30=1,073,741,824 第6轮扩增 2 第5轮扩增 实际拷贝数=(1+x) 1.8530=103,550,417n 循环次数 n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数

理想拷贝数=2n

PCR技术简史

核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善

1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……

PCR技术简史

核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善

1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等 人发明了聚合酶链反应(PCR) 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复 制 然而，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR, 由于该酶不耐热，使这一过程耗时

,费 力，且易出错

PCR技术简史

核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR, 其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有 所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加 入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆 菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪