Agilent 1200培训资料

Agilent 1200 LC

现场培训教材

安捷伦科技有限公司

生命科学与化学分析仪器部

Agilent 1200培训资料

一、 培训目的：

● 基本了解1200LC硬件操作。

● 掌握化学工作站的开机，关机，参数设定,学会数据采集,数据分析的

基本操作。

二、 培训准备：

1、仪器设备： Agilent 1200LC

● G1310A :(单元泵)；G1312A，G1312B XL(二元泵)；G1311A(四元泵)。 ● G1329A（标准型自动进样器）。

● G1316A,G1316B XL（柱温箱）。

● G1314B,G1314C XL（VWD检测器）。

● G1362A（示差检测器）。

● G1315B ,G1315C XL (DAD检测器)。

● G1365B ,G1365C XL (MWD检测器)。

● G1321A (FLD检测器)。

● 色谱柱: Zorbax Eclipse XDB-C18 150 x 4.6 mm, 5um column

P/N 993967-902 /5063-6600

2、溶剂准备：

● 色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇。

● 二次蒸馏水

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基本操作步骤:

(一)、开机：

1、打开计算机,进入Windows 2000（或Windows XP）画面。（IP 地址由Bootp Service 程序写入）

2、打开 1200 LC 各模块电源。

3、待各模块自检完成后，双击“Instrument 1 Online”图标，化学工作站自动与1200LC通讯，进入的工作站画面如下所示。

4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 点击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。

5、把流动相放入溶剂瓶中。

6、打开“Purge”阀。

7、点击“Pump”图标，点击“Setup pump”选项，进入泵编辑画面。

8 、设Flow：3-5ml/min，点击“OK”。

9、点击“ Pump ”图标，点击“Pump control”选项，选中“On”，点击“OK”，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。

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10、点击“Pump”图标，点击“Pump Control”选项，选中“Off”，点击“Ok”关泵， 关闭Purge valve。

11、点击“Pump”图标，点击“Setup pump”选项，设Flow：1.5ml/min。

12、点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以四元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。 也可输入停泵的体积。点击“Ok”。

（二）数据采集方法编辑：

1、 开始编辑完整方法：

● 从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，点击“Ok”，进入下一画面。

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2、方法信息：

● 在“Method Comments”中写入方法的信息（如：This is for test!）。 ● 点击“Ok” 进入下一画面。

3、泵参数设定：（以四元泵为例）

● 在“Flow”处输入流量,如1.5ml/min，在“Solvent B”处输入70,(A=100-B-C-D) ,也可Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

● 点击“Ok”进入下一画面。

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4、自动进样器参数设定:（以标准型G1329A为例）

● 选择合适的进样方式, 如图所示，进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为6号。“Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---可以点击“Edit ”键进行进样程序编辑。

● 点击“Ok”进入下一画面。

5、柱温箱参数设定:

G1316A : 在”Temperature”下面的空白方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>” 键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱的温度左右一致。

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G1316B: 在”Temperature”下面的空白方框内输入所需温度或与检测池一致,并选中它,点击”more>>” 键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱的温度左右一致或与检测池一致。

● 点击“ok”进入下一画面。

6、VWD检测器参数设定:

G1314B: 在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间, 如>0.1min (2s)。最快采样速率13.74HZ。

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G1314C: 在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间, 如>0.1min (2s)。最快采样速率55HZ。

● 在Timetable 中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击“ok”进入下一画面。

7、DAD检测器参数设定:

G1315B: 检测波长: 254nm,BW=4nm, 参比波长=360nm,BW=100nm;

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● 检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域 。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit-狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。

G1315C XL:可以开启光学单元温度控制;可以设定8通道信号等。

●

点击“Ok”进入下一画面。

8、 RID检测器参数设定:

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● 色谱条件:

进样体积: 20ul ; 流速：1.5ml/min; 光学单元温度: 35℃ ;柱箱温度：25 ℃;极性: 正 ;峰宽(响应时间) : 4s 。

● 如图所示: “Optical Unit Temperature”---若环境温度控制在±2℃,设定

为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。

● ***** 点击RID图标，选择“RID Control“ ：Heater 设为“On”，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为“ON”。手动purge 参比池，将其设为“On”，并输入Purge 时间。

9、 FLD检测器参数设定

:

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色谱条件：

● 样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为1:10。

● ODS Hypersial column 125mmx4.0mmIDX5u.

●流动相：A:Water 35% B:乙睛 65%

● 进样体积：5ul; 柱温箱: 30℃ ; EX=246nm, EM=317nm ;PMT=10。 ● 响应时间=4s. 停止时间： 4min。

● Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。 ● Emission: 发射波长: 280-900nm, 步长为1nm,或Zero Order。

● PMT:多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。 ● “Peak width”：大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。 ● Multi Ex ： 多波长及光谱（激发）。

● Multi Em：多波长及光谱（发射）。

● 同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。

10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，点击“Ok”。

11、点击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，点击“Ok”。

12、 从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后点

击“Change” 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击“Ok”.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows 2)。

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13、 从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如下图所示，

输入操作者名称，如zzz；在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。

区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Prefix-在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。

14、 点击“ok”,从“Instrument ”菜单选择“System on”，或依次点击图

标开启各模块。

15、 等仪器Ready，基线平稳，从“RunControl”菜单中选择“Run

method”，进样。(若无自动进样器，则基线平稳后，进样并搬动手动进样阀，启动运行。)（DAD, VWD色谱图如下所示：）

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（三）、数据分析方法编辑:

1、 从“View”菜单中，点击“Data analysis”进入数据分析画面。

2、 从“File”菜单选择“Load signal”， 选中您的数据文件名，

如下图所示。点击“Ok“， 则数据被调出。

3、 做谱图优化：

从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项，如下图所示。从“Ranges” 中选择“Full”或“Auto scale ”及合适的显示时间或选择”Use Ranges” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。点击“ok”。

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4、积分:

● 从“Integration”菜单中选择“Integration Events”选项，如下图所示。选择合适的“Slope sensitivity”，“Peak width”，“Area reject”，“Height reject”。 ● 从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。

● 如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

● 点击左边“√”图标，将积分参数存入方法。

5、打印报告:

● 从“Report”菜单中选择“Specify report”选项，进入如下图所示画面。 ●点击“Quantitative Results”框中“Calculate”右侧的黑三角，选中“Percent”（面积百分比），其它选项不变。点击“Ok”。

● 从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如

想输出到打印机上，则点击“Report” 底部的“Print”钮。

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(四)、关机:

● 关机前，先关灯，用相应的溶剂充分冲洗系统。

● 退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。

● 关闭Agilent 1200各模块电源开关。

(五)、Agilent 1200 LC维护保养：

● 色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙睛/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。

*● 手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口。

● 流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。 *●带seal-wash的 1200，要配制90%水+10%异丙醇，开启seal-wash清洗泵，溶剂不能干涸。

● 注意事项及本手册未包括的仪器见说明书，或由现场工程师介绍。

****注意：

3 本教材仅适用于现场工程师培训讲解参考之用，

内容为工作站现场培训的一般要求，请根据用户的仪器配置及现场用户的需求进行相应的培训

内容增删。

4 安捷伦公司对本教材可能存在的错误及其后果

不承担任何法律责任，我们适时推出新版本的培训教材，恕不另行通知。

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维护知识问答

1 为什么溶剂和样品要过滤?

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。

色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

2 为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？

HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项. 清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力，不能干涸。

3 为什么Agilent 1200LC的流动相管路非常细?

在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低 。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent 1200LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。

毛细管线分类：0.17mm内径 ------绿色 ;0.12mm内径-------红色。 PEEK 管线：内径 -----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。

毛细管线优点: 柔韧性好.

***Agilent 公司同时备有1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。

4 流动相使用前为什么要脱气？

流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致