TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeN(6)

● Q&A

Q1. 回收DNA时，一般使用多少洗脱液洗脱？

A1. 可以根据所需浓度计算使用洗脱液的体积，一般情况下，洗脱液体积大于30μl即可洗脱Column上90%以上的DNA（但要注意洗脱液需直接加至膜中央），所以洗脱液体积最好大于30μl，当对DNA 浓度要求较高时，也可以适当减少洗脱液体积至20μl，但回收率会略有下降，应注意使用预热的洗脱液洗脱，并在洗脱离心之前静置1分钟以上，以提高洗脱效率。

Q2. 本试剂盒一次可以回收的DNA量的范围是多少？

A2. 本试剂盒中Column一次回收的最大吸附量可达20μg以上，最小DNA起始量也可低至500 ng，所以使用前请对DNA样品的总量进行估算。

Q3. DNA的收量较低，为什么？

A3. 一般情况下，DNA的回收率可以达到50-80%。DNA收量较低时，可以从以下几个方面考虑：

①胶块体积过大，单个Column可以承载的凝胶体积最好小于300 mg，大于300 mg的凝胶，请使

用多个Column进行回收，否则收率较低。

②使用请确认Buffer WB中是否加入了指定体积的乙醇。

③溶胶未完全。溶胶时注意观察胶块是否完全溶解，胶块未完全溶解会严重影响收量。溶胶时，间断

颠倒混匀溶胶液有助于胶块的快速溶解。

④溶胶液pH值过高。溶胶后注意观察溶胶液颜色，若溶胶液的颜色由黄色变为橙色或粉色表明溶胶

液的pH值过高，会造成DNA收量较低，此时应向溶胶液中加入3 M醋酸钠（pH5.2）10μl,混合后至溶胶液颜色变回黄色时，再将溶胶液转移至Column上进行后续操作。

⑤使用离心方法时，注意要在常温下离心，使DNA更好地和Column上的膜结合。

⑥洗脱前的空离步骤不可省略，此步骤可以除去Column上残留的洗液中的乙醇，否则影响洗脱效率。

⑦洗脱时将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

Q4. 长片段DNA回收时应该注意哪些问题？

A4. 当DNA片段长度较长（10 kb以上）时，回收效率会有所下降，这是DNA切胶回收时的常见现象。

此时建议按以下方法解决问题：

①适当增加待回收DNA样品的添加量（如起始量加至2～5μg）。

②由于长片段DNA不易从滤膜上洗脱下来，建议使用加热至60℃的Elution Buffer洗脱DNA，

可以提高回收效率。

③减少操作过程中对长片段DNA的物理损伤：如振荡混合操作不要过于剧烈，切胶时不要将DNA

长时间暴露于紫外灯下，在进行电泳时可以使用6×Quadricolor-loading Buffer（Code No. 9171）判断核酸的迁移情况，避免使用紫外灯反复照射观察核酸迁移情况。

④使用适合长片段DNA回收的β-Agarase（Code No. 7345）进行DNA片段的琼脂糖凝胶回收实

验。

Q5. 回收得到的DNA反应性能不佳（酶切、连接），为什么？

A5. ①洗脱液中残留部分盐离子，加入Buffer WB后室温静置5分钟，有助于彻底清洗掉Column上残留的盐离子。

②洗脱液中残留乙醇，在向Column中加入洗脱液之前，将Column在室温下静置2分钟有助于使

Column上残留的乙醇彻底挥发，然后再加入洗脱液洗脱。

③进行DNA洗脱时用灭菌蒸馏水或Elution Buffer洗脱。

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