cDNA文库的构建方法与原理

一些生物学主要的实验方法系列2

cDNA文库的构建方法与原理

蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。

1．基本原理

cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。

cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途：

首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。

第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。

第三，每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性几率比较低，从阳性杂交信号选择出来的阳性克隆一般含有目的基因序列。

第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的测定，读码框（ORF）的界定，只有通过对mRNA5’核苷酸序列才能获得。

2．基本方法

2．1 mRNA纯化

构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种：

·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。

·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。

·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。

2.2 cDNA的合成与克隆

一些生物学主要的实验方法系列2

2.2.1 cDNA第一条链的合成

所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。

目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAase H酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERSCRIPT反转录酶，缺少C-末端180个氨基酸，完全去除了其RNAase H酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。

2.2.2 cDNA第二条链的合成

合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”，即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA，则单链cDNA分子的3’末端自身环化，形成发卡结构。以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA，在其相当于mRNA5’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环，得到可供克隆的双链cDNA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mRNA5’的序列出现缺失和重排，并造成克隆效率偏低，故该法基本上己被一些改进的方法所代 …… 此处隐藏：3025字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……