中医药管理局标书(3)

本研究基于多年临床经验和前期大量基础研究工作，旨在进一步寻求以中西医结 合为主，具有良好价效比，适合中国国情的治疗和预防糖尿病血管病变的有效方药。 为了进一步探讨该方的作用机制，特设计此实验以深入研究，也为其将来的开发提供 科学试验依据。

三、 主要研究内容和技术方案 一.研究内容 1. 糖尿病血管病变

早期阶段病理改变的内在机制研究。 2.中药对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用效果评估。 3.中药对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用的机理研究。 4.中药预防和治疗糖尿病多系统作用途径研究。 5.评价中药和化学药物对于糖尿病血管病变的早期预防和治疗的效果差异。 6. 中西医结合对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用效果评估。 7.筛选预防和治疗糖尿病血管病变有确切作用效果的中药 二、技术方案 、拟采取的研究方法、技术路线和实验方案 1. 实验对象： 清洁级近交系雌性 Wister 大鼠 42 只，6 月龄，重约 150g-200 g,由湖南省 中医药大学动物实验中心提供。 2. 实验材料饲料及饲养环境： 空白对照组常规饮食，造模组喂给高糖高脂高胆固醇饲料。此饲料由本院实 验动物中心自配，其中含 10%蔗糖，10%猪油，2.5%胆固醇。每笼 10 只，自由摄 食、饮水。室温 18-22°C,空气流通，相对湿度 55-70%,12 小时光照维持，昼 夜循环。 药品及试剂： 滋肾活血汤为湖南省中医药大学附属岳阳医院中药房一次性购买。 二甲双胍：北京嘉德制药有限公司生产。 实验试剂 NO 试剂盒 碧云天生物技术研究所

INS 放免试剂盒 TNF-α 放免试剂盒 ET 放免试剂盒 SABC 免疫组化试剂盒 浓缩型 DAB 显色试剂盒

北京北方生物技术研究所 北京北方生物技术研究所 北京北方生物技术研究所 博士德生物工程有限公司 博士德生物工程有限公司

主要仪器： BIOMIAS 图像分析系统： 湖南中医药大学基础研究院

日本尼泰克 ACE919 型全自动生化分析仪。 法国 S-500P 半自动生化分析仪。 光镜:OLYMPUS BX50 日本产 电镜:日本 JEM-1010(HC)100KV 高衬度透射电子显微镜 3. 实验方法： 造模方法：造模组高糖高脂高胆固醇饲料喂养 2 个月后，禁食 12 小时，断尾 取血，血糖值为 16.7mmol/l-25mmol/l 者入选。造模成功后，各组恢复常规饮 食。 分组方法：动物购回，适应性喂养一周后，随机分成空白对照组、模型对照 组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组(n=6) ,除空白对照组外，其他动物 均用于造模。造模后，选择符合模型标准的大鼠分别随机分组如下：模型对照 组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组，各组数量保持相等，每组均为 6 只。 给药方法：从造模成功后的第一天开始给药，疗程为 8 周。灌胃情况如下： 1 ○中药组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的 10 倍，即 6ml/kg,每日 1 次， 共 8 周； 2 ○二甲双胍组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的 10 倍，即 6ml/kg,每日 1 次，共 8 周； 3 ○中药+二甲双胍组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的 10 倍，即 6ml/kg,每 日 2 次，共 8

周； 4 ○模型对照组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的 10 倍，即 6ml/kg,每日 1

次，共 8 周； 5 ○空白对照组：每日灌相当于临床成人用药量的 10 倍的生理盐水，即 6ml/kg, 每日 1 次，共 8 周； 测试指标及取材 动物给药 8 周后，处死前 12h 禁食，股动脉取血约 4~5ml,其中 1.5ml 于 EDTA+抑肽酶的抗凝试管内，用做 ET 的检测。余血放置于试管内，离心取血 清，备做 NO、INS、TNF-α、TG、BUN、CREA、UA 的检测。立即取胰腺、肝脏、肾 脏病理切片：HE 染色；股动脉、腹主动脉病理切片：MASSON 染色 4.统计方法： 所有数据均采用 SPSS 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差( x ±S)表示。两样本均数比较采用成组 t 检验(One- Sample T Test) ,多样本均 数的两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA) 。以 P<0.05 作为有显著性 差异。 5.技术路线： (附图于后) 实验开始前，随机抽取 6 只大鼠作为空白组对照组，并立即断头处死，取血 标本测定生化指标。然后迅速剥离取出双侧髂股动脉、腹主动脉、胰腺、肾脏用 生理盐水冲洗，10%福尔马林原位固定 24h,常规制片，动脉用 MASSON 染色，内 脏用 HE 染色，做光镜、电镜检查。造模成功后，选取成模大鼠，随机分成模型对 照组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组。除模型对照组外，余组均给药。 治疗 8 周后，将全部大鼠处死，收集上述生化、放免及病理切片等各项指标。各 组为 6 只算入统计，认真详细记录所有数据。

技术路线附图如下：购 入 清 洁 级 Wistar 大 鼠 40 只 ， 适 应 性 喂 养 周。 1 34 只大鼠喂高 糖 高脂高胆固醇饲 料 ( 10% 蔗 糖 ， 取 6 只断头处 死 作为空白对照组 取血生化指标：FPG、TG、HDL、 TC。 取肝、胰、肾、股动脉、腹主动脉 做病理切片，准备光镜和电镜检

8 周后取 6 只 大鼠做 上述指 标

10% 猪 油 ， 2.5% 胆固醇) ,共 8 周。

模型对照组

用药 8 周后各组分别处中药组

死，测所有指标。

二甲双胍组

中药+二甲双胍组

统计指标，评估标 本，发表论文，实验 结束。