5,6透射电镜样品制备-生物技术

时间：2026-01-20

透射电镜生物样品制备技术

把需要观察的生物材料制成适合电镜观察的特殊样品，这一系列的样品制作过程叫做样品制备技术。

这是电镜研究工作成败的三大关键问题(电镜操作、样品制备、图像观察分析)之一。

基本要求：1.超微结构保存良好，无明显的物质凝聚、丢失或添加等人工假象。 2.超薄，一般500Å左右。 3.有良好的反差。 4.切片均匀，无皱褶、刀痕、震颤痕及染色剂沉淀。

操作的基本环节：

1.取材从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物中取得所需要材料的过程

【1】原则：(1)新鲜。(材料离体后一分钟内进入固定液) (2)体积小。( < 1mm3,特别是厚度<1mm) (3)机械损伤小。(动作轻巧，器械锋利) (4)低温操作。(降低酶的活性，减少组织自溶) (5)取材部位准确。(局限性光镜配合多点取材做好标记)

[2]方法：(1)动物或人体组织的取材：麻醉或急性处死剪取一小块组织冷戊二醛固定液中20分钟洁净的硬纸上(已滴了一滴冷却的固定液) 切成1mm宽，2~3mm长的小条切成1mm3的小块入盛有冷的固定液的小瓶中

(2)体外培养细胞的取材：贴壁细胞需先用胰酶消化细胞低温/普通离心机，离心(2000r/min)15min 弃培养液 PBS洗3次立即倾斜离心管，沿管壁缓缓加入戊二醛

置0~4℃冰箱

2.固定：用化学固定剂迅速杀死细胞的过程。目的：保持生前结构及空间定位。【1】固定液的组成：固定剂：蛋白质交联成凝胶，使核酸、糖类、脂类变为不溶性缓冲剂：维持恒定PH值附加剂：维持适当渗透压，避免肿胀、皱缩，避免析出、沉淀

常用戊二醛、锇酸双固定法。

【2】常用固定剂的特点

(1)戊二醛(Glutraldehyde) 1)2.5%戊二醛固定液的配制(见书) 2)固定原理及优缺点a、戊二醛对于蛋白质、多糖、核酸以及细胞内微管、滑面内质网、纺缍丝、胞饮小泡和细胞基质固定良好。 b、穿透力强，可达4mm/h,常用作前固定。 c、固定后可在4℃冰箱长时间保存(数周~数月)。 d、对酶的活性保存较好，适用于电镜细胞化学研究。 e、对脂肪不起固定作用。 f、无“电子染色”作用。 g、不稳定、易氧化。

(2)锇酸(又称四氧化锇。OSO4, ) 1) 1%锇酸固定液的配制：(见书) 2)固定原理及优缺点a、经典的固定剂。对蛋白质和脂质亲和力强。 b、有强烈的电子染色作用。 c、渗透较慢，0.25~0.5mm/h左右。常用作后固定。 d、对糖类和核酸保存很差，不保存酶活性。 e、固定时间不宜超过2小时。 f、提前配置，应低温、密封、避光保存。配置时应彻底清洗器皿，并要避免接触金属物品

。 g、剧毒、易挥发。 h、比较昂贵。

(3)其它固定液：

多聚甲醛(Paraformaldehyde):对细胞精细结构的保存不如戊二醛，但在酶活性的保存上却优于戊二醛，一般多用于组织化学或快速固定。

高锰酸钾：对脂蛋白膜有良好的固定作用。

【3】戊二醛、锇酸双固定操作程序：

a、预冷的2.5%戊二醛，前固定2小时或几个月，4℃。 b、0.1M磷酸缓冲液(PH7.2)冲洗3次，每次15~20分钟，4℃。 c、1%锇酸固定液后固定2小时，4℃。 d、0.1M磷酸缓冲液冲洗3次，每次5分钟，4℃。

3、水洗与脱水：脱水：用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水。常用脱水剂：乙醇(和丙酮)

50%→70%→80%→90%→无水乙醇(或丙酮)(2~3次) 每步10~20分钟(培养细胞时间可短些，致密组织时间长些), 除无水乙醇(或丙酮)在室温下进行外，其余均应在4℃下进行。

可在70%乙醇中加2%铀盐块染：电子染色。

4.浸透与包埋：是将组织块制成能进行超薄切片的硬块。 (1)目的与要求：不怕潮湿、粘度低、易浸透，易溶于脱水剂；聚合均匀，聚合后体积收缩小；固化后硬度适中，有良好的切割性能；对电子轰击稳定，具热稳定性；透明度好，高倍时本身不产生任何微细结构；不产生背景反差；不阻碍重属盐染色。

(2)包埋液的组成：

包埋剂：环氧树脂(不易与乙醇相溶) 固化剂：十二烷基琥珀酸酐(DDSA)和六甲酸酐(MNA) 增塑剂：邻苯二甲酸二丁酯(DBP) 加速剂：2、4、6-三(二甲氨基甲基)苯酚。(DMP—30)