血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

发布时间:2024-09-20

血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

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血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

分离纯化的一般程序选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化(预处理) 预处理)

(粗分级,细分级) 粗分级,细分级)

分析及鉴定

血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

实验目的通过从血清中分离、纯化、鉴 清白蛋白和γ 清白蛋白和γ-球蛋白的实验,培养学 生综合应用盐析、离心、色谱、电泳 分光等技术来分离纯化特定蛋白质的 技能。

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实验原理1. 初分级: 血清经饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白 初分级: 血清经饱和硫酸铵 饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。

2. 脱盐:用凝胶色谱法除去分离样品中的盐类。 脱盐: 凝胶色谱法除去分离样品中的盐类 3. 细分级: 用离子交换色谱法从白蛋白粗分离样 细分级: 离子交换色谱法从白蛋白粗分离样品中提取纯化的白蛋白;从球蛋白粗分离样品 提取纯化的γ 提取纯化的γ-球蛋白。

4. 鉴定: 用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。 鉴定:

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操1. 盐 析

原理: 原理: 当高浓度盐存在时,蛋白质往往凝 聚并析出沉淀。该技术为“盐析” 聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。

不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在 半饱和硫酸铵溶液中,血清球蛋白会沉淀,经 半饱和硫酸铵溶液中,血清球蛋白会沉淀,经 离心后,可与白蛋白分离开。 离心后,可与白蛋白分离开。 影响因素:PH、温度、蛋白质纯度等。 影响因素:PH、温度、蛋白质纯度等。 逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。

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操一、盐析

-- 白蛋白、γ球蛋白的粗分离 白蛋白、 <1> 取0.5ml血清 0.5ml血清 0.5ml饱和 饱和(NH 溶液, <2> 取0.5ml饱和(NH4)2SO4溶液, 缓慢滴入,边加边摇。 缓慢滴入,边加边摇。 混匀后于室温中放置10分钟。 10分钟 <3> 混匀后于室温中放置10分钟。 8000r/min× <4> 8000r/min×10min 小心吸取上清液,作为纯化白蛋白用。 <5> 小心吸取上清液,作为纯化白蛋白用。 沉淀加0.5ml蒸馏水,使之溶解, 0.5ml蒸馏水 <6> 沉淀加0.5ml蒸馏水,使之溶解,作为纯化 γ球 蛋白用。 蛋白用。

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2. 脱

盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵 离子成分, 样品中含有过高的离子浓度 会影响离子交换层析的效果,所以在用 离子交换层析进行细分级前需要脱盐。 离子交换层析进行细分级前需要脱盐。 凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱 盐方法,同时可将蛋白质转换到用于离 子交换层析的低离子强度缓冲液中。

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凝胶过滤的原理

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洗脱液中蛋白质及盐分的检查取96孔板一块,上四排加20%磺基水杨酸,下 96孔板一块,上四排加20 磺基水杨酸, 20% 孔板一块 三排加BaCl 三排加BaCl

2液。 从下端管口取1滴洗脱液,滴于20 从下端管口取1滴洗脱液,滴于20%磺基水杨 20% 酸中,出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出, 酸中,出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出, 开始收集蛋白样品。 开始收集蛋白样品。 从下端管口取1滴洗脱液,滴于BaCl 从下端管口取1滴洗脱液,滴于BaCl2中,出现 白色混浊或沉淀即有盐分析出,不再收集。 白色混浊或沉淀即有盐分析出,不再收集。

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二、G-25凝胶层析脱盐 25凝胶层析脱盐(一)葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备 葡聚糖凝胶G 25层析柱的制备 (二)上样与洗脱: 上样与洗脱:1、小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上缓冲液面刚 小心控制凝胶柱下端活塞, 好下降到凝胶床表面( 好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床 表面以致空气进行凝胶床) 表面以致空气进行凝胶床)。 2、关紧下端出口,用滴管吸取盐析球蛋白液,小 关紧下端出口,用滴管吸取盐析球蛋白液, 心缓慢的加到凝胶床表面上( 心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中 冲起或破坏凝胶床表面的平整) 冲起或破坏凝胶床表面的平整)。

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3、开下端出口,使样品进入凝胶床(刚好下降到 开下端出口,使样品进入凝胶床( 凝胶床表面),关闭出口,小心加入适量pH6.5 ),关闭出口 pH6.5的 凝胶床表面),关闭出口,小心加入适量pH6.5的 Ac缓冲液 缓冲液。 0.02mol/L NH4Ac缓冲液。 4、放开,流速约20滴/分钟,立即收集并检测, 20滴 分钟,立即收集并检测, 放开,流速约20 20%磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管 10滴 三管, 20%磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管,10滴/管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。 5、 BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出, 检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出, 不再收集。 不再收集。 6、平衡再生:继续洗脱30ml。 平衡再生:继续洗脱30ml 30ml。 7、白蛋白样品脱盐。 15滴/管,收集三管。 收集三管 三管。 白蛋白样品脱盐。 15滴

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3. 纯

离子交换色谱是蛋白质提纯中得到 最广泛应用的方法之一。它是以离子交换 剂为固定相,利用蛋白带电部分与具有相 反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同,而 将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技 术。

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原理: 离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱 性基团作离子交换基团,通过静电作用与 带有相反电荷的离子(反离子)结合。当 流动相中存在其他相反电荷的离子时,就 与结合在固定相交换基团上的反离子进行 交换。

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阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作 为离子交换基团,能吸附流动相中的阳

离 子。 阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作 为离子交换基团,能吸附流动相中的阴离 子。

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0.02M NH4ACAC- AC+ +

蛋白样品+ +- - + - ++ +

0.06-0.3M NH4AC

+

-

-

AC- AC+ +

AC- + AC-

+阴离子交换剂

+

AC-

AC-

+

AC- + AC-

-

- -

+

AC-

AC- γ-球蛋白带正电白蛋白, 白蛋白,α、β

+

NH4+

+ +得到纯化的γ 得到纯化的γ-球蛋白

-

球蛋白带负电 球蛋白带负电

NH4+

得到纯化的白蛋白 得到纯化的白蛋白

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三、纯化(阴离子交换层析) 纯化(阴离子交换层析)将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上, 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上, DEAE纤维阴离子交换柱上 用0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗脱, Ac缓冲液洗脱 缓冲液洗脱, 分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管,10滴 分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管,10滴/管, 球蛋白) 编号。(纯化的γ-球蛋白) 编号。(纯化的 。( 继续洗脱30ml 继续洗脱30ml 将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上,用0.06mol/L NH4Ac洗 Ac洗 将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上, 脱30ml 。(去掉α、β -球蛋白,午餐休息1小时) 。(去掉 去掉α 球蛋白,午餐休息1小时) 改用0.3mol/L 改用0.3mol/L NH4Ac洗脱,检测到蛋白后立即收集三管, Ac洗脱 检测到蛋白后立即收集三管, 洗脱, 15滴 15滴/管,编号。(纯化的白蛋白) 。(纯化的白蛋白 编号。(纯化的白蛋白) 再生: 0.3mol/L NH4Ac 20ml, 0.02mol/L NH4Ac40ml 20ml, 再生:

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