血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

血清白蛋白、 血清白蛋白、γ-球蛋白 的分离、纯化及鉴定 的分离、

血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

分离纯化的一般程序选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化(预处理) 预处理)

(粗分级，细分级) 粗分级，细分级)

分析及鉴定

血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定

实验目的通过从血清中分离、纯化、鉴 清白蛋白和γ 清白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学 生综合应用盐析、离心、色谱、电泳 分光等技术来分离纯化特定蛋白质的 技能。

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实验原理1. 初分级: 血清经饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白 初分级: 血清经饱和硫酸铵 饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。

2. 脱盐:用凝胶色谱法除去分离样品中的盐类。 脱盐: 凝胶色谱法除去分离样品中的盐类 3. 细分级: 用离子交换色谱法从白蛋白粗分离样 细分级: 离子交换色谱法从白蛋白粗分离样品中提取纯化的白蛋白；从球蛋白粗分离样品 提取纯化的γ 提取纯化的γ-球蛋白。

4. 鉴定: 用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。 鉴定:

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操1. 盐 析

作

原理: 原理: 当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝 聚并析出沉淀。该技术为“盐析” 聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。

不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在 半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经 半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经 离心后，可与白蛋白分离开。 离心后，可与白蛋白分离开。 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。 逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。

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操一、盐析

作

-- 白蛋白、γ球蛋白的粗分离 白蛋白、 <1> 取0.5ml血清 0.5ml血清 0.5ml饱和 饱和(NH 溶液， <2> 取0.5ml饱和(NH4)2SO4溶液， 缓慢滴入，边加边摇。 缓慢滴入，边加边摇。 混匀后于室温中放置10分钟。 10分钟 <3> 混匀后于室温中放置10分钟。 8000r/min× <4> 8000r/min×10min 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。 <5> 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。 沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解， 0.5ml蒸馏水 <6> 沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化 γ球 蛋白用。 蛋白用。

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2. 脱

盐

盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵 离子成分， 样品中含有过高的离子浓度 会影响离子交换层析的效果，所以在用 离子交换层析进行细分级前需要脱盐。 离子交换层析进行细分级前需要脱盐。 凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱 盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离 子交换层析的低离子强度缓冲液中。

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凝胶过滤的原理

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洗脱液中蛋白质及盐分的检查取96孔板一块，上四排加20%磺基水杨酸，下 96孔板一块，上四排加20 磺基水杨酸， 20% 孔板一块 三排加BaCl 三排加BaCl

2液。 从下端管口取1滴洗脱液，滴于20 从下端管口取1滴洗脱液，滴于20%磺基水杨 20% 酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出， 酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出， 开始收集蛋白样品。 开始收集蛋白样品。 从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl 从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现 白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。 白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。

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二、G-25凝胶层析脱盐 25凝胶层析脱盐(一)葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备 葡聚糖凝胶G 25层析柱的制备 (二)上样与洗脱： 上样与洗脱：1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚 小心控制凝胶柱下端活塞， 好下降到凝胶床表面( 好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床 表面以致空气进行凝胶床) 表面以致空气进行凝胶床)。 2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小 关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液， 心缓慢的加到凝胶床表面上( 心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中 冲起或破坏凝胶床表面的平整) 冲起或破坏凝胶床表面的平整)。

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3、开下端出口，使样品进入凝胶床(刚好下降到 开下端出口，使样品进入凝胶床( 凝胶床表面),关闭出口，小心加入适量pH6.5 ),关闭出口 pH6.5的 凝胶床表面),关闭出口，小心加入适量pH6.5的 Ac缓冲液 缓冲液。 0.02mol/L NH4Ac缓冲液。 4、放开，流速约20滴/分钟，立即收集并检测， 20滴 分钟，立即收集并检测， 放开，流速约20 20%磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管 10滴 三管， 20%磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，10滴/管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。 5、 BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出， 检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出， 不再收集。 不再收集。 6、平衡再生：继续洗脱30ml。 平衡再生：继续洗脱30ml 30ml。 7、白蛋白样品脱盐。 15滴/管，收集三管。 收集三管 三管。 …… 此处隐藏：1290字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……