DNA 的复制与重组

一，DNA的复制

Waston and Crick, 1953

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中心法则现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点—— 在 生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位， 而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。 从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。

2 DNA的半保留复制

半保留复制(semiconservative replication) 即新的双链DNA中，一股链来自模板， 一股链为新合成的。

半保留复制的意义 复制的这种方式可保证亲代的 遗传特征完整无误的传递给子代， 体现了遗传的保守性。

半保留复制实验依据1958年M.Messelson 等用实验予 以了证实

双螺旋结构是半保留复制的分子 基础

3 DNA的半不连续复制 前导链(leading strain): 为连续合成，合成方向与解链方

向一致，它的模板DNA链是5’~3’链。 随从链(lagging strain):不连续合成，在RNA引物基础上 分段合成DNA小片段(冈崎片段),方向与解链方向相反， 它的模板DNA是3’~5’链。

4 DNA的复制过程4.1 与复制有关的酶和因子(以原核生物 大肠杆菌为例)1. 原料： dNTP,Mg++ 2. 双链DNA模板 3. 引物(primer),小片段的DNA或RNA,常是RNA,有游离的 3’OH。 4. 引物酶(primase,DnaG),用于合成复制所必需的RNA引物

5. 解螺旋酶 ( helicase ) , DnaB, 由DnaA和DnaC协助在复制的起始 点(Ori C)上解开双螺旋。

6.

单链结合蛋白(SSB,single stranded binding protein)稳定已经解开 成两股的DNA单链，防止其退火复性。 拓扑异构酶(DNA topoisomerase) DNA 分子中存在打结，缠绕、连环的超螺旋现象。 I 型酶： 切开双链中的一股，使DNA不致打结，切口的3’端可通过 自由转动一周再与5’端磷酸连接，不需ATP。 II 型酶：切断处于超螺旋状态中双股链中的某个部位，通过切口使 超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢复复制所要求的负超螺旋状态。(注: 拓扑一词的含义是指物体或图象作弹性移位而又保持物体不变的性质。)

7.

8. DNA聚合酶(DNA polymerase) 聚合酶III ——主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能有从5’——3’ 延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方 式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3’ OH以3’,5’ 磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi 。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是 5’ 3’ 有从3’——5’ 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸

聚合酶 I 用于切除引物RNA,并填补留下的空隙 有从5’——3’ 延伸多核苷酸链的聚合酶的活性； 有从3’——5’ 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸； 有从5’——3’ 外切酶的活性，其作用是切除引物 聚合酶II 活性弱,作用与聚合酶III

相似 有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性； 有从3’——5’ 外切酶的活性

真核的DNA聚合酶 真核DNA的复制至少涉及5种复制酶α、β、 γ、δ和ε,其中α、δ、ε参与染色体DNA的复制。

α有引物要求；β负责DNA的修复； γ的功能是线粒体DNA的复制。

9. DNA连接酶(ligase)

将不连续的DNA片段以3’,5’磷酸二酯键连接起来，原核 生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗 ATP

5 原核生物DNA的复制

Replication of the E. coli chromosomeIn 1963, John Cairns’ Technique: Grew E. coli in 3H thymidine Waited till cells were in the middle of replication Lysed the cells very very gently Spread the lysate on an EM grid Exposed the grid to X-ray film for TWO months.

What Cairns’ experiment (1963) showed:

E. coli has a circular chromosome. E. coli has a single origin of replication. In E. coli, replication and unwinding are simultaneous.