AxyPrep质粒DNA小量试剂盒

本试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。适合于从1-4 ml细菌培养物中提取多至20 μg高纯的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

一、 试剂盒组成、贮存、稳定性

Cat. No.

制备次数 制备管

2 ml离心管 1.5 ml离心管 RNase A Buffer S1 Buffer S2 Buffer S3 Buffer W1

Buffer W2 concentrate Eluent 说明书

AP-MN-P-4 AP-MN-P-50 AP-MN-P-250

4 preps 50 preps 250 preps

4 50 250 4 50 250 4 50 250 10μl30μl150μl 2 ml 15 ml 75 ml 2 ml 15 ml 75 ml 2.5 ml 21 ml 105 ml 2.8 ml 28 ml 135 ml 2.4 ml 24 ml 2×72 ml 1 ml 5 ml 25 ml 1 1 1

RNase A：50 mg/ml，室温可贮存6个月，长期贮存于-20°C。 Buffer S1：细菌悬浮液。加入RNase A后，混合均匀，4°C贮存。 Buffer S2：细菌裂解液（含SDS/NaOH），室温密闭贮存。 Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。

Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（可用100%乙醇或

95%乙醇）。混合均匀，室温密闭贮存。 Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

二、注意事项

Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。

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三、实验准备

1. 第一次使用前，RNase A全部加入Buffer S1中，4°C贮存。

2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。

3. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。

4. 使用前，检查Buffer S2是否出现沉淀，应于37°C温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。

四、操作步骤

第一次使用时，将试剂盒携带的RNase A全部加入到Buffer S1 中，混合均匀，4°C贮存。

1. 取1-4 ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12,000×g

离心1 min，弃尽上清。

2. 加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

* 确认Buffer S1中已加入RNase A。

3. 加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶

液。此步骤不宜超过5 min。

* Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。 * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 * 此步骤不宜超过5 min。

4. 加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10 min。

* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。

步骤5～7可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。

A. 负压法

5A. 将质粒DNA制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管中，

开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 6A. 加500 μl Buffer W1，吸尽管中溶液。

7A. 加700 μl Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。

* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

8A. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，12,000×g离心1 min。

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B. 离心法

，12,000×g5B. 吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中）

离心1 min，弃滤液。

6B. 将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g离心1 min，弃滤液。

7B. 将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心1 min，弃滤液；以同样的方法

再用700 μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。

* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用

Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。

8B. 将制备管置回2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。

9. 将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μl Eluent或去离子水，室温静置1 min。12,000×g离心1 min。

* 将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。

五、流程图

加250 μl Buffer S1

加250 μl Buffer S2 加350 μl Buffer S3

加500 μl Buffer W1 加700 μl Buffer W2 加700 μl Buffer W2

加60-80 μl Eluent 或去离子水

裂解 中和 结合 洗涤

洗脱

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