生物化工的资料

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第2 4卷

第 2期

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阳

能

学

报

vo . 4. . 1 2 No 2Ap . 2 0 r .0 3

20 0 3年 4月

ACTA ENERGI AE OL S ARI NI S SI CA

文章编号：2 40 9 I0 3 0—2 80 0 5—0 6 2 0 )20 1—4

木质纤维素酒精发酵菌种的筛选李素玉， 陈新芳2田沈2王菊2杨秀山2,,,( .辽宁大学生命科学系，阳 1 0 3; .首都师范大学生物系，京 10 3 ) 1沈 10 6 2北 00 7

摘

要：对木质纤维素水解糖液进行酒精发酵，时代谢葡萄糖和木糖成酒精的 9个菌种以木糖为唯一碳源进行驯为同

化，中选出 3个菌株。并对 3个菌株进行固定化，行酒精发酵研究，从进以进一步阐明该菌株代谢葡萄糖和木糖成酒精的能力。以总糖利用率、萄糖和木糖利用率、精产率为指标，葡酒 3株菌具有较好的同时发酵葡萄糖和木糖成酒精的能力。P cyoe n o h| T C 37 8的总糖 (%葡萄糖和 2 ahsl t np is C 2 2 na iA 5%木糖 )用率达到了 8 .8 (6 )葡萄糖的利用率为利 50% 3 h,

9 .1 (6 )木糖利用率 8 .8 (6 )菌株 C dd hh t T C3 8 7的酒精产率达到理论值的 8 .1。 92% 3h, 0 3% 3h, ai se a eA C 4 8 a a 29%关键词：萄糖和木糖；精发酵；葡酒菌种筛选中图分类号： K1 T 6文献标识码： A

O引言 随着经济的迅速发展，传统能源短缺，切需要迫开发新的替代能源。因此，用生物质获得能源或利燃料显得格外重要。以作物秸秆、材加工废弃物木等这些大量存在的、价的木质纤维素为原料生产廉乙醇，是替代化石能源的重要途径。据报道在木质纤维素中约 3%为半纤维素，纤维素水解产物中 0半 约 9%为木糖 j 0。在木质纤维素的水解产物中，单糖的组成是葡萄糖、糖、露糖、乳糖、拉伯木甘半阿

3个菌株 (属于 P cyoe a n p i s和 C n ia分 ah sl tn o hl n u a dd

s e aad )并进行固定化细胞酒精发酵， 3

株菌 h h te e,对发酵木糖和葡萄糖成酒精的底物利用率、精产率酒和发酵周期进行了研究。

1材料和方法1 1菌种 .

本实验用 9个菌株，们是： a dd rpcl它 C n iat i i o asATCC 3 40 2 2,ATCC 3 6 25 4,ATCC 3 6 25 5,ATCC 3 6 25 7; Ca da h h t e di s e a a ATCC 3 88 4 7; Pa hy o e c s ln t n o ii ATCC 3 6 a n ph l s 2 91,ATCC 3 2 27 8; De r ba y— o c sp l mo ph sATCC 41 2;Sa h r my e 1 my e o y r u 2 7 c a o c s I一r r m 5 5。 a u 21 5

糖 J其中约三分之二为六碳糖，分之一为五碳，三糖 j。六碳糖 (萄糖、露糖和半乳糖 )葡甘由传统酿酒酵母可相当容易的发酵成酒精，五碳糖 (而木糖和阿拉伯糖 )不能由传统酿酒酵母发酵产生乙则

1 2培养基 (/ . g L)

醇 j。近年来的研究表明，些酵母菌和细菌可发有酵木糖产生酒精 j在发酵木糖产酒精的微生物，中， P c yoe a n p i s和 C n ias对 ah sl tn o hl n u a d p研究最 d3。

1驯化筛选培养基：糖2,白胨 5酵母汁3 )木 0蛋，。2 )液体生长培养基：糖 2,白胨 5酵母汁木 0蛋，3 )固定化细胞增殖培养基：糖 2,萄糖木 0葡 5,白胨 3酵母汁 2 5 C C2 . 5 Mg O . 5 0蛋， .,a1 2, S 4 2, 0 0KH2 Po42. 5。

多，有效的菌种是 P c yo ntn o hls C n ia更 ah sl a n p i, a dd e us e aad, i i siis推断为 C n i h h te h htee Pc a t t ( h pi a dd se aa a的有性型 ) Kly eo csmaxa u k, u v rmy e rin s和 C n ia 3 j add 中的一些种 J在 P c yoe a n p i s Pc i。 ah sl tn o hl, i a n u h siis C n i h h tee中， t t和 a dd se aad pi a以假丝酵母中的

4 )固定化细胞发酵培养基：糖 2,萄糖木

0葡 5, a 12 5 Mg O . 5 K P 42 5酵母提取 0 C C2 ., S 4 2, H2 O ., 0

C n iase aad a dd h h te e有较好的代谢木糖成酒精的发酵速率、酒精浓度和酒精产率。本试验通过对 9个菌株的驯化筛选，择出具有较高底物利用能力的选收稿日期： 0 2 1— 1 2 0—0 2

物 2 5蛋白胨 3尿素 0 2。 .,, .413培养方法 .

1 )驯化培养： 9株菌在只含木糖为碳源的驯化培将

基金项目：划项目(0 1 5 4 2 )计 2 0 AA 10 0

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养集中进行驯化，据木糖利用率进行筛选。以木根

X= Cx (/ C2× 0 5 )× 1 0 .1 0%

糖利用率为指标，择出利用木糖产酒精的菌株。选然后将选择出的菌株在初始筛选培养基中进行了 3

式中： X——乙醇产率，;%C——测得的乙醇浓度，/ 1 g L;

个批次的驯化培养，次培养为 7 h条件为 3℃,每 2, 08 rm。 0p

C——糖浓度，/。 2 g L

2 )富集培养：经过驯化培养的菌株 1取 mL移入液体培养基中， 3℃, 5 rm培养 2。各取于 0 10p d 20 0 mL培养液，0 0p离心。将离心后的菌体接 8 0 rm种于液体培养基中，度为 2/ 0 mL浓 g 1 0。并用显微镜直接计数法进行菌量计数。1 4固定化细胞酒精发酵 .

2结果和讨论2 1菌株的筛选 .以木糖为唯一碳源，种 9个菌株，0接 3℃静置培养 4, d对菌株进行驯化，定残糖量，测以残糖量低并产生酒精者作为筛选的指标。从而筛选出 C dd ai as e aa h h t eATCC 4 7, c y o e a no h l 3 88 Pa h s l n t n p ii ATCC s

1 )固定化细胞的制备： 3℃, 5 r m, d的取 0 1 0p 2富集培养物 2 mL与 3%的海藻酸钠溶液 ( 8 ) 6 mL于

3 6 1 P c yoe a n p isAT C 3 7 8等 3个 2 9, ah sl tn o hl C 2 2 n i

菌株。分别属于休哈塔假丝酵母菌属 ( C AT C 3 8 7

和嗜鞣管囊酵母菌属 ( T C 3 6 1和 AT C 48) A C 2 9 C37 8。 2 2 )

常温下混合，加入 1 2 再 .%中， 4下静置固定 1 h于℃ 0。

o3在无菌条件下充，

分搅拌均匀后，注射器滴加到 2的 C C2溶液用% a1 2 )固定化细胞的增殖：制成的固定化菌球将( D≈ 3 m)入增殖培养基中， 0, 0 p增殖 a r放 3℃ 8 rm,

2 2富集培养 .筛选出的 3株菌，在液体培养基中进行恒温震荡培养 2,心收集细胞，为富集培养的接种物。 d离作 接种后 3个菌株的菌浓度： C 4 8 AT C 3 8 7为 2 6 . 3× 1 0 m L A C 29为 2 2 0/ T C 361 . 3× 10 mL, C 0/ AT C。

培养。每隔 1 h更换一次新鲜培养液， 2共增殖 4 h 8。 3 )固定化细胞酒精发酵：用重复式分批发酵采法。固定化菌球用无菌水清洗 3遍后，入发酵培转养基中。于 2 0 5 mL锥形瓶放入固定化菌球，菌球体积和发酵培养液体积的比例为 2:,体积为 3总8 m L。 3℃, 0 p, H 0 0 0 8 r m p 5.。

3 7 8为 2 2 22 . 2×10 mL。经 2 0/ d培养，获得了富集培养物，心后收集细胞，为固定化菌球制备时的离作接种物。 2 3糖的利用率 .

1 5分析方法 .

1 5 1糖浓度分析： ..菌种筛选时用铁氰化钾法测定木糖浓度[菌种驯化和酒精发酵用高效液相色谱 ,仪 ( g—q i ho tga h L Waes 6 0 Hihl udc rmao rp yHP C, t 9 ) i r2测定样品中葡萄糖和木糖的含量。测定条件：氨柱(0×4 6 m)柱温 4℃, tr 1 2 0 .r a, 0 waes 0示差测器， 4流、

斟旺

絮掘l 2 2 4 3 6

动相乙氰：=3:,速 2/ n进样量 2 t 水 1流 mL mi, 0 L。￣按下方程式计算糖含量：X= (× C) S S1/ 2× 1 0 0%

th/

● ATCC3 6 2 9l▲ ATCC3 7 8 2 2 O ATCC3 8 7 4 8

式中： X——样品中糖含量 mg mL;/ S——样品峰面积； C——标准溶液浓度 mg mL;/ S——标准溶

液峰面积；,图 1葡萄糖利用率F g 1 Glc s tl a i n r t琊 t i. u o e u iz t a e i o i me

葡萄糖的利用率：用固定化细胞在 2 0采 5 mL三角瓶中， 3" 8 rm条件下，于 0 C,0p对浓度为 7 g L的混 0/和糖 (萄糖 5 g L:葡 0/木糖 2 g L进行酒精发酵试验。 0/ ) 结果表明，固定化后的酵母细胞较为迅速的利用葡萄糖，6 T C 3 7 8已消耗完培养基中所有的葡萄 3 hA C 2 2糖。3个菌株中以 A C 2 2 T C 3 7 8和 A C 2 9 T C 3 6 1的葡

1 5 2乙醇浓度分析： S .4 0气相色谱仪分析 ..用 P3 2样品中的乙醇含量。初始温度 7℃,终温度 0最 1 0,温速率 1℃/ n温度保持时间 2 n注 0℃升 0 mi, mi,射室温度 5℃,测器温度 5℃,样量 1。乙 0检 0进 L醇产率计算公式：

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报∞如加 加 m 0

萄糖利用率为较高。其结果如图 1所示。 2 4木糖的利用率 . 3菌株对木糖的利用率比葡萄糖利用率低。个 通常认为，核微生物对戊糖的代谢途径比己糖代真谢更为复杂。木糖发酵首先需将木糖还原为木糖醇，然后氧化为木酮糖，一步磷酸化后进入磷酸戊进糖途径，并最终生成乙醇。在葡萄糖和木糖共存的

从图中可知， 3个菌株对总糖的利用能力相似。但 AT C 3 8 7的乙醇生成率要明显优于其它 2个菌 C 4 8株。

情况下， C 4 8 AT C 3 8 7通常先利用葡萄糖，随着葡萄糖量的减少，木糖的利用开始占主导地位，用速对利率逐渐变慢。而采用固定化细胞技术，用凝胶载利

碍

谜

体提供的微环境，以获得高密度的细胞，可有利于加快生化反应，以能够有效缩短发酵周期。从图 2所 可以看出 3个菌株对木糖的利用能力相似。th/

● ATCC 3 6 2 91▲ ATCC3 7 O ATCC3 8 2 28 48 7

图 4乙醇产率Fi 4 Et no i l h tan 7 tm e g. ha ly ed by t e s r is 3 i 5冰、

由以

上的结果可以看出， TC 4 8 A C 3 8 7有较好的发酵葡萄糖和木糖产酒精的效果。

碍旺懈

耀

3结论 1 )9个菌株经驯化后得到了 3个能同时代谢葡萄糖和木糖成酒精的菌株。fh/

● ATCC3 6 2 9l▲ ATCC3 7 o ATCC3 8 7 2 28 4 8

2 )对 3个菌株进行了富集和固定化，增殖，并以葡萄糖和木糖为代谢底物进行酒精发酵。菌种 C n ias e aad T C 3 8 7的木糖和总糖利用 a dd h h te eA C 4 8率与其他 2个菌株相似，乙醇产率达到了但8 91%。 2.

图 2木糖利用率Fi 2 xyo eutl a in r t s tm e g. ls iz to a ev i i

2 5总糖利用率和乙醇产率 .从图 3和图 4可分别看出， 3个菌株对混和糖浓度为 7 g L的底物利用率和相应的乙醇产率。 0/

3 )采用固定化增殖细胞进行酒精发酵具有稳定性强、作简便、酵速度快、产周期短、操发生酒精得率高等优点。由于所固定的活细胞可以重复使用， 减少投资。4 ) P c yoe tn o hls A C 2 9, ah sl n a n p i T C 3 6 1 uP c y oe a n p i sATCC 2 2和 Ca dd h— a h sln tn o hl u 3 78 n ias e

、

蠢{}

h teeA C 4 8 aad T C 3 8 7都具有较好的转化木糖成酒精的能力，要进一步进行驯化，高代谢木糖成酒精需提的能力。

让

5 )除对代谢木糖的能力进行驯化外，还应进一步用实际的木质纤维素水解糖液对该 3个菌株进行th|

诱导驯化，以使其适应木质纤维素水解糖液中的复杂化学组成，提高代谢能力。并

● ATCC 32691▲ A TCC32 728. ATCC34887 O

图 3总糖利用率F g. To a u a t i t n r t i 3 t l g ru i z i a e s la o t i me

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[考文献]参[] Ha r h a, h u ay 1 r K i n C odr i s S GV,f

a ed n ya— S rmi d ya dA yn i Rn . Sm ut ne uss c ha ii nd f r nt to f pr— aD i la o a c rfc a e me a in o e

n l fAp l i o ilg 2 0 9 2 8 2 5 a o p i M c boo y, 0 1, 0: 0— 1 . d e r

[] Sii e PJ B tat , nC u eb reJE,t 1 4 l n r ,oh s R JVa aw n eg ng e a. C n e s n o x ls o e h n l y t e y s a h s ln o v ri f o D- yo et t a o h e tP c y o a b a

tn o hu[] Boeh o g dBonier g 18, an p i sJ . it n l ya i gnei,9 2 l c o n e n1 3— 3 4: 71 84.

t ae nio u etp sLn )ev oehn lJ . r t A t n m l o u( in l e t tao[] e d g p a sJ un l f ora o Ch mia Te h oo y n Boe h oo y e cl c n lg a d itc n lg,1 99, 4: 055 1 0. 9 7 1— 06

[]岑沛霖， 5蔡

谨 .业微生物学[]北京：学工业出工 M .化

版社，0 0 20 .

[] S aeG S p l, v oci ta, olW u n e 2 h n u p E aL Jah e mshlN e D n,ta. Iolto a pr l i r c r t rz t o a 1 s a in nd ei na y haace iai m on f Zy—

[] G og h ui s Hug L, ny Mai e a. 6 ere Mamo r e, n e Nac k, t 1 d E h n l a c mu a in i c l r s o P c y oe t a o c u lt n o u t e f u a h s ln tn o h ls o x ls s a s ca e t r n i o o a n p i n D- yo e i so it wi a ta s in t u d h t

mo n s mo is mu a t wih a l r d p e e e c o mo a b l t n t n at e r f r n e f r i e

x l eadguoeui ain J .Boeh o g etr, yo n l s ti

t[] i en l yL t s s c l o z t o e2 0. 00 22: 57 1 4. 1— 6

as t o w o ye o smpi[] i/eh o g, t e fl x gncnu t n J .Bo t nl y a o o e o1 85. 9— 6 9 5 2.

[ N gm 3] ia J N. D vl me to xls— r e t g yat ee p n f yoef o e ni es m nPihi tpts f r e ha l r du to t r g a a a in c a s iii o t no p o c in h ou h d ptto

[]黄伟坤，编著 .品检验与分析[ .京：国轻工 7等食 M]北中业出版社 .1 9 . 9 3

o ad odhmi ll eai pe yrlst[] Ju— nhrw o e c lo c rh doyaeJ . or eu s d

S TRAI S N CREENI NG N o CoNVERTI G N

To ETHANoL LI GNOCELLUL ELiSu, e n a g Tin S e z W a gj 2 Ya g Xis a 2 yu Ch n Xi f n 2 a h n, n , n u h n u,

( .D p rme t fLi ce c, ioNig Unv ri S e a g, io n 1 e a t n o f S ine L a e n i s y, h n Y n L a NigPrv ne 1 0 3, h n e t o ic 1 0 6 C ia; 2 e a t n fBi o y, a i l o m l ies y, e ig 1 0 3, h n ) .D p rme t o o g C pt N r a vrt B i n 0 0 7 C i l a Un i j a

Absr c: n tanso e me ig glc s n y o esm ut n o sy we e d me tc t d wih t e xyo e a he t a t Ni e sr i ff r ntn u o e a d x l s i la e u l r o sia e t h ls st

s l a b n s u c r m ih 3 s r i s we e s lc e o o v r i g h d o y a e fl n c l ls o e h n lb o ec r o o r e fo wh c t an r ee t d f rc n e t y r l s ts o i o el o e t t a o y n g umir o g n s . es

lc e tan r m mo i z d a n r d c d t t n e m e t to n o d rt e n— co r a ims Th ee t ds r is we e i b l e nd i t o u e o e ha ol r n a in i r e o d mo i f s r t he a lte tl a in r t g u o e u i z t a e, ls tl a i n r t n t a o ed.Pa hy oln t a e t bi isofu ii to a e, l c s tl a i r t xyo e u i z to a ea d e h n lyil i z i on i c s e

tn o hl a n p is ATC 3 7 8 h d h g e bl y t o v r g u o e a d x ls i la e u l o eh n lwi u— i C 2 2 a i h r a i t o c n e t l c s n y o e smu t n i o sy t t a o t s b h

s neuizt nrt f oa guoea dx l e(% gu oea d2 x l e s er 5 0% ( 6 )teuiz— t c ti i ae tl lcs n yo 5 a lao ot s l s n % y s)in a .8 3 h,h ti c o 8 lat n o l c s s 9 . 1 i fg u o e i 9 2% a t r 3 h f r e t t n, n 0. 8 o yo e i c n u d a t r 3 h i c b t n o f 6 e e m n a i a d 8 3% f x ls s o s me fe 6 n u a i . o oEt a 0 h r tc lv le o di h h t eATCC 4 7 r a h d t 2. . h n lt e e ia au fCa da s e a a o 3 88 e c e o 8 91% Ke wo d g u o e a d x l s y r s: l c s n y o e;e ha o e e t to t n lfr n a i n;s e ee to m e d s lc in

联系人 E—malxy n@ ma .n .d .n i:sa g i c u eu c l

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