跨界融合选育生物脱硫催化剂(2)

跨界融合选育生物脱硫催化剂

第6期　　　　　　　　　　　　　　沈齐英等.跨界融合选育生物脱硫催化剂

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仪器有限公司生产的CL3010高效毛细管电泳液相色谱一体机。2.3　主要试剂

脱硫微生物驯化中使用的混合有机硫化合物苯并噻吩、二苯并噻吩、4,62二甲基二苯并噻吩和苯硫醚均为ACROS公司产品。原生质体融合实验中使用的溶菌酶和蜗牛酶为中国科学院上海生化所产品;使用的青霉素和制霉菌素为ACROS公司产品。测定DBT含量时使用的溶剂正十六烷为德国HALTERMANN公司产品。2.4　主要培养基实验中使用的无机盐培养基、富集培养基、琼脂平板培养基、斜面培养基、基本培养基、完全培养基、再生选择培养基的配方及配制方法见参考文献[4～6]。

鉴别培养基1为基本培养基中加入青霉素(Penicillin,Pc);鉴别培养基2入制霉菌素(Nystatin,Nt);2.5　2.5.1　取5g被原油污染的土壤充分溶于100,从中取出10mL接种于80mL无机盐培养基和10mL原油混合液中(原油中分别加入0.1mmol/L的苯并噻吩、二苯并噻吩、4,62二甲基二苯并噻吩和苯硫醚),混合液置于恒温振荡器中,在120r/min、28℃条件下,振荡培养48h(1个周期);取振荡培养后水相液体10mL,重新接种于80mL无机盐培养液和10mL

条件下,振荡培养12h和24h后,测定有机相中DBT的含量。测得的DBT浓度越小,说明微生物

脱硫效果越好,即为优势脱硫菌种[8]。2.5.4　二苯并噻吩含量的测定　DBT的定量采用高效液相色谱法。高效液相色谱仪的使用条件及方法:调节高效液相色谱检测波长为254nm,流动相为90%的甲醇水溶液,流速为1mL/min,C18色谱柱温为25℃,进样量20μL。在使用条件下,测定各标准DBT溶液浓度对应的峰面积,由色谱工作站绘制成DBT浓度与对应峰面积的标准曲线,通过测定各样品中DBT的峰面积即可确定DBT的量[9]。2.5.5　原生质体融合　(subsp.),以。:活化出发菌株→制备原生质→原生质体再生→检出融合子。凡是在再生选择培养基上呈丝状生长的菌落,将其接种到斜面培养基上4℃冰箱保存[10,11]。2.5.6　出发菌株和融合后丝状生长的菌株抗生素抗性实验及其形态学比较　活化富集出发菌株和融合后丝状生长的菌株,以鉴别培养基制成倾注平板后,置于32℃培养箱内培养观察,在鉴别1、鉴别2和鉴别3培养基内均呈丝状生长菌落可以认为是融合子,将其接种到斜面培养基上冰箱保存备用。2.5.7　融合子的筛选　融合子的筛选方法与2.5.3节相同。

2.5.8　融合子的增殖培养及稳定性检验　融合子

原油混合液中,在120r/min、28℃条件下,振荡培

养48h;如此重复10个周期(480h)[7]。2.5.2　菌种的琼脂平板分离和保存　驯化10个周期结束后,水相液体以画线分离的方法进行琼脂平板分离菌种后,置于30℃恒温培养箱内培养,待琼脂平板培养基长出孤立菌落后,将孤立菌落转接于斜面培养基上,置于4℃冰箱保存备用。2.5.3　脱硫微生物的确定(脱硫菌株的筛选)　菌种的活化富集培养:以无菌操作将保存在斜面培养基上的菌株接种于100mL富集培养基中,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃的条件下振荡培养24h后使用离心机,在6000r/min、15℃条件下离心分离收集菌体,制备0.5g/mL菌悬液备用(0.5g湿菌体悬于1mL无机盐培养基中)。分别取浓度为2.72mmol/L和5.44mmol/L的DBT正十六烷溶液10mL,与90mL0.5g/mL菌悬液混合,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃

活化富集培养后离心分离收集融合子,取0.5g湿

重融合子,接种于100mL富集培养基中,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃条件下振荡培养24h后;离心分离收集富集培养后的融合子,取0.5g湿重融合子,重新接种于100mL富集培养基

内,相同条件振荡培养,收集融合子;如此重复5个周期。每1周期结束后检测融合子的脱硫能力(方法同融合子的筛选),观察融合子脱硫的稳定性。2.5.9　脱硫融合子对成品油中有机硫的脱除实

验　脱硫融合子富集培养后离心收集菌体,将其接种于85mL无机盐培养基和15mL93号汽油混合液中,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃条件下振荡培养12h后,分离油相;将分离获得的油相,与重新接种脱硫融合子的85mL无机盐培养基混合,置于恒温振荡器内,在120r/min、28℃条件下振荡培养12h;如此循环3个周期。同时进行