高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD07b株的分离鉴定及Nsp2基因同源性分析

中国畜牧兽医 2010年第37卷第3期生物技术#91#

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD07b株

的分离鉴定及Nsp2基因同源性分析

邱深本,苏丹萍,黄爱芳,罗映霞,赵志权,贺东生

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(1.广东科贸职业学院生物技术系,广州 510430;2.华南农业大学兽医学院,广东省人兽共患病重点实验室,广州 510642)

摘要:在某集约化猪场采集疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病死猪的肺、淋巴结等病料,进行检测,将RT-PCR检测结果为阳性的病料处理后接种Marc-145细胞,培养72~96h后细胞单层出现明显的CPE。收获病毒经RT-PCR方法检测,并将此PCR产物经纯化后连同引物送相关公司进行测序,结果显示,该病毒为繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因缺失株,将该病毒命名为HPPRRSV-GD07b株。将GD07b株序列与国内外19株PRRSVNsp2基因进行比较分析,结果表明,该毒株Nsp2基因与CH-1a株等4株PRRSV经典株同源性较低,为60.5%~81.6%;而与14株变异株同源性较高,为90.6%~98.9%。

关键词:高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒;分离;鉴定;Nsp2基因

中图分类号:S858.28 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2010)03-0091-03

2007年5月初某猪场暴发疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highlypathogenicporcinerepro-ductiveandrespiratorysyndrome,HPPRRS),发病仔猪临床表现发病急,病猪突然卧地不起,呼吸沉重急促,体温升高,食欲减退,全身发红,眼结膜炎,眼屎封眼,口鼻和两耳发紫,粪便干硬,临死前出现神经症状,最后呼吸困难、身体发抖、四肢无力侧卧而死。本试验从发病猪场采集病猪病变组织,进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)的分离鉴定与Nsp2基因的分析比较。现将试验过程报道如下。1 材料与方法

1.1 材料 某猪场采集到的疑似HPPRRS病料。普通PRRS疫苗、HPPRRSV阳性血清、HPPRRSV阴性血清、非洲绿猴肾细胞衍生细胞系(Marc-145)均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。RNAisoplus、ExTaqDNA聚合酶、2.5mmol/LdNTP、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂(ribonucle-aseinhibitor)、10.0mmol/LdNTP、DNAMarker

收稿日期:2009-09-21

作者简介:邱深本(1967-),男,广东人,硕士,副教授,研究方

向:动物疫病防控。

通信作者:贺东生(1968-),男,广西人,博士,副教授,主要从事

预防兽医学研究。E-mail:dhe@http://www.77cn.com.cn;Tel:020-85280243

基金项目:广东省科技计划(2007A02030006-4)和广东省农业

。

DL2000、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品;DNA

提取试剂盒为深圳尚能生物科技有限公司产品(生产厂家:UPENERGY,产品编号:NP3042-60);DEPC为Genview公司产品;总RNA提取试剂Bio-zol购自北京百泰克生物技术有限公司;Tris-饱和酚、氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂为国产分析纯。乙醇、中性甲醛液(浓甲醛120mL,加蒸馏水880mL,磷酸二氢钠4g,磷酸氢二钠13g)、石蜡、二甲苯、苏木精)伊红染色液。

1.2 方法

1.2.1 疑似病料处理与RT-PCR检测 取疑似HPPRRS临床症状的猪肺脏、淋巴结,经过普通斜面、营养肉汤和血琼脂无菌检测,3种培养基都无菌生长,把病变组织在无菌环境中剪碎、研磨、组织匀浆器匀浆后,置于灭菌的EP管中-80e保存备用。

应用生物学软件Primer5.0设计扩增PRRSVNsp2部分序列的特异性引物,引物序列为:上游引物P1:5c-GCGACAATGTCCCTAACG-3c;下游引物P2:5c-CTGGTA(G)CGTCAGCGTTGTT-3c,由TaKaRa公司合成。扩增区间为2751~3040bp,该引物可扩增缺失株和经典弱毒疫苗株,预期扩增产物长度分别为:缺失株约200bp,经典弱毒疫苗株约290bp。

抽提病变组织的总RNA反转录后进行PCR反应,PCR反应条件为:94e预变性5min;94e变性40s,60e退火30s,72e延伸40s,30个循环;最后72e延伸10min,同时设不加模板的空白对

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测。在紫外凝胶成像系统观察结果并摄像保存。1.2.2 病原的细胞分离和病毒滴度测定 选取满度大于75%的单层Marc-145细胞,倾弃旧培养液,加入已稀释的病毒悬液,置于37e培养箱中感作30min,弃去病毒悬液,加入新鲜维持液(含小牛血清2%,双抗1%),继续培养观察并记录细胞变化。并用Marc-145细胞测定分离毒株第4代细胞培养物的病毒滴度(TCID50/mL)。

1.2.3 分离毒株Nsp2基因核苷酸与推导的氨基酸序列及其系统发育树分析 分离毒株细胞分离物RNA的提取与RT-PCR检测方法同1.2.1。将经RT-PCR鉴定为阳性的回收产物连同设计的引物,送上海英骏生物技术有限公司测序。运用DNAS-tar软件将测序获得的PPRRSV流行毒株Nsp2基因序列截短并进行整理,与国内外已发表的19株PRRSVNsp2基因序列进行核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析,建立系统发育树进行比较,分析Nsp2基因变异情况。2 结果与分析

2.1 临床病料RT-PCR检测结果 送检的疑似HPPRRS猪肺、淋巴结、脾、脑等病料均在约200bp处出现了目的条带(图1),因特定引物扩增条带涵盖HPPRRSNsp2区域,根据产物大小可知该片段是

Nsp2基因特定缺失片段(赵志权等,2008)

。

图1 临床病料的RT-PCR检测结果

注:M,DNAMarkerDL2000;1,HPPRRSV阳性血清;2,

PRRSV阴性血清;3,PRRS经典弱毒疫苗株;4,肺;5,淋巴结;6,脾;7,脑。

2.2 病原的分离与鉴定 病毒接种Marc-145细胞进行培养,初代培养的第3天开始出现细胞病变,

经传2代,分离物能在Marc-145细胞上适应生长和复制,CPE呈现特征性的变化过程,即受感染的细胞在接种后48h首先出现细胞圆缩,集聚呈灶状,膨大,然后固缩脱落 …… 此处隐藏：5279字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……