及浓度发生改变，否则会影响所分离的蛋白质纯度。

2. 可用20％三氯乙酸溶液代替磺基水杨酸溶液来检验洗脱液中有无蛋白质。

3. 用HCl处理DEAE-纤维素时，时间不宜过长，否则DEAE-纤维素会发生变质。

5. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白质分离纯度的原理是什么？

答：以聚丙烯酰胺凝胶作为载体

由丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺聚合交联而成。

引发剂是过硫酸铵，催化剂为四甲基乙二胺。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

还原剂β 巯基乙醇，它能破坏蛋白质的二硫键，使蛋白质的构象和形状改变，几乎全部呈长椭圆棒状，

6. 不连续凝胶电泳的支持体由什么组成？

答：由分离胶和浓缩胶组成。上层为浓缩胶，一般Acr为2％ ~ 3％，缓冲液为不同浓度的Tris-HCl、pH值为6.8左右；下层为分离胶，Acr为5％ ~ 10％，缓冲液常用Tris-HCl，pH值为8.8。上、下电泳槽盛有pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，上电泳槽接电源的负极，下电泳槽接正极。

7．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中应注意的是什么？

答：1）丙烯酰胺(Acr) 和双丙烯酰胺(Bis) 有很强的神经毒性，最好戴手套、口罩。

2）不要用洗衣粉和刷子擦洗电泳平板玻璃板。

3）微量进样器针头极易堵塞，吸样后应及时清洗；玻管中的金属芯子不宜拔出，防止弯曲和弄脏。

4）吸取溶胶的滴管、吸管等，要立即排空和冲洗，以防凝固堵塞。

5）实验过程中，注意勿弄破平板玻璃。

8、指示剂：溴酚蓝；染色剂：考马斯亮蓝；步骤：取样、制胶、电泳、剥胶、染色

9、浓缩胶中迁移率：cl->蛋白质->甘氨酸-

实验四 碱性磷酸酶的Km值测定

1. 碱性磷酸酶的Km值测定实验原理是什么？

以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4—氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

2. 请写出Michaelis-Menten方程

答： 上式中Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数，而其中的V则表示反应的起始速度。

2. 何谓Km？

米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。大多数酶的Km值在0.01~100 mmol／L间。

5．实验中应注意的是什么？

答：1．血清取量要准确。2．酚标准曲线必须是过原点的一条直线。

第五版块生物学实验技术在医学研究中的应用

实验一 血清谷-丙转氨酶活性测定

1. 血清谷-丙转氨酶活性测定的原理是什么？

以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在谷-丙转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，再利用显色剂2，4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成丙酮酸二硝基苯腙。此化合物在碱性溶液中呈棕色

2. 实验中应注意的是什么？