实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

实验一 蛋白质和氨基酸的 呈色反应

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

一、实验目的 1、了解蛋白质和氨基酸的呈色反应原理 2、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方 法。 3、了解呈色反应在定性和定量分析中的应用。

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

(一)双缩脲反应1、原理

一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但 有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

2、试剂 (1)尿素 (2)10%氢氧化钠溶液 (3)1%硫酸铜溶液 (4)2%卵清蛋白溶液3、操作 (1) 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加 热使尿素熔化，尿素放出氨 。熔化的尿素开始硬化 时，停止加热，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠 溶液约1ml,振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再 振荡。观察出现的粉红颜色。添加要避免过量硫酸铜， 否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 (2)向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化 钠溶液约2ml,摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加 随摇。观察紫玫瑰色的出现。

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

(二)茚三酮反应NH3 CO2 RCHO

+水合茚三酮(无色)

加热

(弱酸) 还原性茚三酮

+

+ 2NH3 +还原性茚三酮 水合茚三酮

3H20

紫色化合物 570nm

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

2、试剂 (1)蛋白质溶液 (新鲜蛋清：水=1:9) 100ml (2)0.5%甘氨酸溶液 (3)0.1%茚三酮水溶液 (4)0.1%茚三酮-乙醇溶液 3、操作 (1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶 液1ml,再各加0.5ml 0.1%茚三酮水溶液，混匀， 在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫 色再变蓝。 (2)在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液， 风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液， 在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。剂 i ]

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

(三)黄色反应1、原理

剂 i ]

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

2、试剂 (1)鸡蛋清溶液 (2)头发 (3)指甲 (4) 0.5%苯酚溶液 (5)浓硝酸 (6)0.3%色氨酸溶液 (7)0.3%酪氨酸溶 液 (8)10%氢氧化钠溶液 3、操作 向6个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出 现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加 热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10% 氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

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管 号

1

2剂 i ]

3

4

5

6

材料 (滴) 浓硝酸 (滴) 现象

蛋白 质 溶液 42

指甲少许 40

头发少许 40

0.5% 苯酚 44

0.3% 色氨 酸 44

0.3% 酪氨 酸 44

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(四)乙醛酸反应1、原理

剂 i ]

紫红色

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

2、试剂： (1) 蛋白质溶液 鸡蛋清：水=1:20 (2) 冰醋酸 (3) 浓硫酸(分析纯)剂 i ]

3、操作 向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸约1ml, 倾斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(A.R.)约1ml, 使其重叠，勿使两者混合。静置后，观察在两液界 面上出现的红紫色环，于水浴中微热，可帮助颜色 形成。 用20%白明胶

作乙醛酸反应。白明胶分子中无色氨 酸，所以不呈此反应。

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(五)考马斯亮蓝反应1、原理 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。 在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当 它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。 它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速 度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室 温一小时内稳定。在0.01-1.0mg蛋白质范围 内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常 用来测定蛋白质含量。

实验一 蛋白质和氨基酸的呈色反应-

2、试剂 (1)蛋白质溶液(鸡蛋清 : 水=1 : 20) 5 ml (2)考马斯亮蓝染液 300 ml 考马斯亮蓝G250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中， 加100 ml 85%磷酸混匀，配成原液。临用前取 原液15 ml,加蒸馏水至100 ml,用粗滤纸过滤 后，最终浓度为0.01%。

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3、操作 取2支试管，按下表操作试 剂 蛋白质溶液 (ml) 管号 1 0剂 i ]

蒸馏水 (ml) 1 0.9

考马斯亮蓝 液(ml) 3 3

2

0.1